五味子及其內生菌代謝產物的研究進展

黃楊竹，石悅煒，張艷梅，權春善，金黎明

(大連民族大學 生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605)

五味子(Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.)隸屬于八角目木蘭科五味子屬植物，《新修本草》中有記錄，五味子果肉、果皮甘甜微酸，果核味辛苦，果實整體帶有咸味，因而得名五味子[1]。五味子產地主要以黃河為界分成南、北兩大產區，北五味子主產于遼寧丹東、本溪地區；南五味子主要分布在長江岸線及中國西南部。作為中國傳統藥用植物的五味子最早被記載于《神農本草經》，有主補益精氣、治療咳嗽、喘息、過勞體傷的功效，因此常用于肝膽氣虛、頭暈、失眠、乏力等癥狀。五味子中發揮藥理作用的化學成分主要是多糖類、木脂素類、揮發油類、三萜化合物以及有機酸等[2]。現代研究顯示五味子具有降低血糖、保肝護肝及促進機體免疫的作用，在心血管類疾病、呼吸系統類疾病、抗腫瘤和增強免疫力等方面具有廣闊的應用前景，是優質藥品、食品、調味品的重要原料[3]。由于五味子顯著的藥用和保健功效，其野生資源慘遭大肆采挖，現在已然成為國家三級重點保護藥用植物品種。隨著野生藥用植物資源的減少，其內生菌因具有易于發現新化合物、易于擴大培養、不受季節限制等優勢而日漸引人矚目。

植物內生菌是指存活于健康植物體組織中，不會引起宿主產生病害癥狀或侵染現象，甚至會對宿主有益的微生物[4]。藥用植物的內生菌會與宿主植物共同或分別產生一些有藥用價值的物質，如抗病菌、抗腫瘤、抗氧化等活性成分，這些物質可直接成為優質藥用資源，或經過誘導而催生的次級代謝物成為植物藥用成分的一部分[5]。相關研究結果顯示，藥用植物都含有內生菌，長時間的協同進化使得內生菌可以產生與宿主結構功能相同或相仿的代謝物質[6]。與內生菌共生的藥用植物會生成更多的活性物質，究其原因可能是內生菌產生的代謝物質能夠刺激宿主生成特定產物，或宿主生成藥理物質的關鍵酶[7]。內生菌的存在可以協助宿主植物提高抗逆能力，也可以促進植物對土壤中各種營養元素的吸收，同時也會通過產生植物激素加快宿主植物的生長發育[8]。基于宿主植物和內生菌間的相互作用關系，以及微生物繁殖快、培養易于控制、成本低等優勢，藥用植物內生菌成為尋求藥理活性成分的理想資源。近年來，在對五味子藥理成分需求逐漸加大的情況下，加快對五味子內生菌的研究將從一定程度上緩解五味子植物資源短缺的問題。

1 五味子內生菌的種類

五味子內生菌主要種類具體情況見表1。

表1 五味子內生菌種類詳情

1.1 五味子內生真菌及其種類

在五味子內生菌中，內生真菌的含量比較豐富，學者的相關研究也較為深入。GAO[9]從產地為湖北恩施的五味子根系中分離得到一株內生真菌，為鏈格孢屬(Alternariasp.)，能夠產生一定的抗性藥物。趙玥等[10]在對遼寧地區野生北五味子內生真菌的分離研究中，純化得到23株內生真菌，植株根部的內生真菌含量豐富。鄭春英等[11]從五味子植株中果實、根莖和藤莖部位分離得到26株內生真菌，其中青霉菌(Penicilliumsp.)9株、曲霉菌(Aspergillussp.)12株、毛霉菌(Mucorsp.)2株以及其他種屬3株，它們對常見的致病菌都有一定的抑制效果。張譽薺等[12]從三年生北五味子植株種子中分離得到4株真菌，經過鑒定分別屬于為青霉菌、擴展青霉(Penicilliumexpansum)等，其中被鑒定為青霉菌的WZ3代謝產物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制性。

1.2 五味子內生細菌及其種類

對五味子內生細菌的研究沒有內生真菌的范圍廣，但分離出細菌株數也較為可觀。曹聰等[13]從小興安嶺地區北五味子果實中分離純化得到31個屬的內生細菌，其中最多的是藍藻門細菌，占總獲得內生細菌總量的88.19%。徐麗等[14]從健康五味子植株的根部分離出了大量內生細菌，總計322株，其中來自沈陽農業大學藥材基地的內生細菌占比最大，約為47.5%。篩選出322株中對五味子莖基腐病菌、人參銹腐病菌和穿山龍黑斑病菌有拮抗作用的3株內生細菌，發現它們分別屬于黃假單胞菌(Pseudomonassynxantha)、沙雷氏菌(Serratiagrimesii)和蒙氏單胞菌(Pseudomonasmonasmonteilii)。金巖等[15]從五味子植株的根、莖、葉中分離純化得到了302株內生細菌，并發現植株根部的內生細菌含量和存活率是最高的，其次是莖，含量最低的部位是葉片。經過統計得出約有24.19%的內生細菌對植物致病菌有較好的拮抗作用，不同來源的五味子內生細菌的拮抗能力存在差異。

2 五味子及其內生菌中的活性成分

2.1 木脂素類

木脂素是一類天然化合物，屬于植物雌激素，大部分呈游離狀態，少部分結合為糖苷儲存于植物的樹脂中。木脂素可以保護植物不受微生物和食草動物的傷害，還具有抗腫瘤、保護肝臟、保護中樞神經、抗氧化、抗病毒等生物活性。在五味子植株中，木脂素類活性成分含量最多，高達8%。關于木脂素生物合成的現有資料顯示，參與該成分合成代謝的關鍵酶有苯丙氨酸解氨酶、香豆酸-3-羥化酶、松脂醇-落葉松酯酚還原酶、肉桂醇脫氫酶、蛋白氧化酶[16-17]。許哲祥等[18]從野生五味子中分離得到內生真菌WJ1，通過其發酵而得到的木脂素含量明顯高于生藥五味子的含量，其中五味子醇甲的含量比生藥五味子含量高2倍左右，五味子甲素增加率不低于25%。毛瑞華[19]從金山五味子內生真菌毛殼菌屬(Chaetomiumsp.)中通過液態發酵得到4種木脂素產物，后續又從其須根部位內生菌中通過固態發酵得到2種木脂素產物。

2.2 揮發油類

五味子中揮發油主要存在于植物的果實、種子、葉片和莖等部位，其主要成分是萜類化合物，如單萜類、倍半萜類等，還含有少量的酸和醇。五味子中揮發油成分能夠增強機體的防御能力和應激反應能力，也可以起到調節中樞神經的作用，該成分能夠促進DNA的合成以及提高淋巴細胞的增生而達到加強免疫力的效果[20]。有研究發現，北五味子油具有抑制α-糖苷酶的作用，降低餐后血糖峰值，提高胰島素的敏感性，保護胰腺。五味子油還可以通過升高超氧化物歧化酶(SOD)減少脂肪過氧化并提升葡萄糖的被轉運能力，增強胰島素的分泌[21]。程敏等[22]利用響應面法，得到超臨界二氧化碳萃取五味子揮發油類的最優條件：萃取壓力33 MPa，萃取溫度53 ℃，萃取90 min，CO2流量21.40 mL·min-1，該條件對種子油的提取率為8%。周玲等[23]通過單因素試驗及響應面法得到五味子揮發油最佳提取條件：液固比為10，浸泡4.3 h，提取時間5.5 h，該條件可得五味子揮發油0.013 mL·g-1。對于五味子果實中揮發油類，崔九成等[24]利用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)分析出30個物質，經鑒定其中α-檀香烯含量高達14.30%；β-雪松烯含量為12.30%；γ-杜松帖烯含量占總油量的12.79%，由此可看出五味子揮發油中主要是倍半萜類化合物。鮑英杰等[25]發現選用乙二醇低共熔溶劑萃取(DES)得到的五味子油有較好的抗氧化能力，且黏性較低便于操作。

2.3 多糖類

五味子中富含多糖類物質，總多糖含量約占8%，其粗糖類成分有護肝、抗氧化、益膽、抗疲勞等功效，在降血糖以及治療糖尿病方面作用也較為明顯，Jin等[26]發現，五味子多糖上調了葡萄糖轉運蛋白-4(GLUT-4)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(P-AMPK)等蛋白質的表達量水平，表明該成分可以利用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和胰島素信號通路減少葡萄糖的消耗。高曉旭等[27]揭示了多糖具有降低糖尿病模型小鼠的體重以及控制血糖升降的作用。此外，研究發現五味子多糖可以改善D-半乳糖誘導的小鼠腦萎縮，并提高腦衰老小鼠的學習和記憶能力[28]。五味子淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)內生真菌的糖苷類代謝產物3-亞甲基0-β-D-吡喃葡萄糖基-1,2-二酚，也具有抗細菌和抗腫瘤的能力[29]，該物質對金黃色葡萄球菌有良好的抑制效用，同時也能抑制單增李斯特菌和枯草芽孢桿菌。苗昊等[30]的研究顯示五味子多糖可以通過抑制卵巢癌細胞自噬作用，加強癌細胞內質網應急凋亡程度，從而抑制癌細胞的生長。

2.4 其他類化合物

五味子及其內生菌中的次級代謝產物除了常見的木脂素類、揮發油類和多糖類之外，還有一些罕見的物質被研究者提取出來。張萍等[31]從北五味子果實的內生細菌WF17發酵液中分離得到原兒茶酸成分，是一類存在于植物中的酚酸物質，多從冬青科植物葉片中獲得，具有抗腫瘤、抗致病菌和抗氧化的活性，在臨床上被用來治療慢性氣管炎等疾病。沈瑋蕓[32]在狹葉南五味子中分離得到293株內生真菌，其中一株被鑒定為青霉菌，在該真菌的發酵液內確定得到了12種三萜化合物；在另一株被鑒定為哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的真菌發酵液中分離得到尼哥納樂酸，是一種三萜酸，可抑制HIV-1逆轉錄酶的活性，促進腦源性神經因子的表達，在神經病理中有廣闊的應用前景。目前對五味子中有機酸的研究較少，但其有機酸含量豐富，包含檸檬酸、蘋果酸、丁二酸等。

3 五味子及其內生菌代謝產物的藥理作用

3.1 抗菌作用

研究者盡管在抗生素發掘方面取得了較大進步，但疾病的發生和發展以及耐藥性仍是醫學界的大問題，因此從藥用植物中探索出新的抗菌性活性成分依舊是醫藥界研究的熱點。與其他藥用植物一樣，五味子中也存在許多抗菌性物質。劉月月等[33]采用水煎法加入3倍五味子重量的蒸餾水浸泡1 h后煮30 min，制作得到濃縮五味子水提物，分別對大腸桿菌、藤黃微球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌進行抑菌試驗，發現該水提物對它們均有抑制作用，且對革蘭氏陰性菌的抑制性較為強烈。林雄平等[34]利用乙醇和水提取南五味子根部的黃酮類物質有較好的抑菌作用，醇提法對南五味子根部的黃酮類物質的提取率比水提法高5.87%，且醇提法所得物質對啤酒酵母、黑曲霉都有抑制作用，對黑曲霉的效果最佳。林雄平等[35]還發現南五味子老根、幼根、老莖、幼莖、葉的乙醇提取效率不相同，對葉片的提取率達到17.44%，猜測可能是葉片中存在著許多生化途徑和儲藏了大量營養物質所致。除幼莖的提取物質對枯草芽孢桿菌無抑菌效果外，其余部位的提取物都對測試菌有較為可觀的抑制效果。用五味子中提取的木脂素處理大腸桿菌后發現大腸桿菌的細胞壁受損，木脂素使得細胞膜出現破裂導致了自身的裂解，從而達到了抗菌效果[36]。部分研究者對五味子抗菌成分及其作用機制的探討見表2。

表2 五味子抗菌成分及其作用機制

3.2 抗腫瘤作用

中藥抗腫瘤作用已經是現今研究界的熱門方向，譬如青蒿琥酯可以抑制乳腺癌細胞的增殖；川陳皮素能夠通過一系列反應將細胞阻礙于G1期；槲皮素可以誘導癌細胞的死亡；大黃素甲醚通過調節誘導信號導致癌細胞的凋亡和自噬等[41]。中華傳統藥用植物的抗腫瘤活性成分受到越來越多的關注，五味子中能夠被用于腫瘤治療的有效成分主要是木脂素、三萜化合物和多糖類，各成分作用機制見表3。有研究者在對非小細胞肺癌的治療實驗中采用了五味子甲素和表皮細胞生長因子(EGF)受體抑制劑結合處理癌細胞，發現五味子甲素可以刺激肺癌細胞對藥物的敏感性，從而肺癌細胞被誘導周期停滯甚至凋亡[42]。

表3 五味子抗腫瘤成分及其作用機制

3.3 抗氧化作用

人類機體因為氧化作用而產生的氧化自由基不穩定，會毀傷機體，引起衰老和慢性疾病。在生物進化過程中出現了一套完整的保護體系清除多余的氧自由基，現在對中藥的研究成果也表明自然界擁有能夠抗氧化的活性物質，例如五味子中的木脂素。馬瑩慧等[49]將五味子木脂素中的五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子醇乙與等濃度維生素C相比較測定其抗氧化能力，結果得出五味子木脂素成分有較好的抗氧化能力，能夠清除超氧陰離子自由基。五味子抗氧化成分及其作用機制見表4。

表4 五味子抗氧化成分及其作用機制

3.4 其他藥理作用

五味子的生物活性成分對肝病的治療作用較好，臨床研究發現五味子對肝纖維化、病毒性肝炎、肝癌等病癥有較好的預防和治療效果。Chen等[56]研究發現五味子乙素能夠通過對CCl4誘導進行體內肝纖維化治療，該成分可以改善肝功能、減少膠原蛋白的沉積，經過調節相關信號通路預防肝纖維化的進展。也有研究發現[57]五味子多糖和木脂素對酒精和乙酰氨基酚引起的小鼠急性肝損傷有保護作用，因為酒精會導致機體氧化應激反應異常，加上過量乙酰氨基酚處理后機體會出現肝臟抗氧化能力弱，誘發肝細胞的損壞，而五味子多糖和木脂素都有抗氧化的功能，能夠保肝護肝。五味子的有效活性成分在動物實驗結果中表現出提高小鼠的學習能力、減少神經元衰老和保護中樞神經的功效。肖飛等[58]的研究表明五味子醇甲可以提高中樞神經細胞的活性，預防疾病效應優于治療作用，一定程度上也能減少中樞神經細胞的損傷。五味子己烷提取物可以通過內皮依賴性一氧化氮(NO)途徑引起血管舒張，以及肌球蛋白輕鏈(MLC)去磷酸化直接作用于血管平滑肌細胞，從而維持心血管的舒張[59]。五味子其他藥理作用及其作用機制見表5。

表5 五味子其他藥理作用及其作用機制

4 結 語

中國可入藥的植物種類非常豐富，其中也不乏充足的內生菌資源。近年來研究者們對五味子及其內生菌的代謝產物進行了大量的研究，發現五味子的內生真菌和內生細菌都會產生與宿主植物相同或相似的有效成分，這為大批量、快速度獲得目的藥理成分提供了可能。藥用植物五味子中的主要有效活性成分有木脂素、三萜化合物、揮發油類以及有機酸和多糖類，而且從五味子內生菌代謝產物中還分離出了五味子植株未發現的活性成分。其中，五味子木脂素的可應用范圍最為廣泛，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病菌的作用，對心血管疾病、肝病和中樞神經系統疾病都有預防和治療的效用。