Ferrostatin-1通過抑制鐵死亡延緩D-gal誘導的心肌細胞衰老的研究

熊喜成，王一平，王剛，張甜，包雅麗，迪娜·艾尼瓦爾，孫湛，2△

《中國心血管健康與疾病報告2020概要》表明，2018年心血管疾病死亡占我國城鄉居民總死亡原因的首位［1］。隨著老齡化的加劇，心血管疾病發生率明顯增加［2］。基于Logistic 回歸模型對心血管疾病風險的預測顯示，隨著年齡的增長，心血管疾病死亡風險迅速上升［3］。因此，以心臟衰老作為心血管疾病突破口具有重要意義。D-半乳糖（D-gal）是常用的模擬衰老藥物。研究表明，D-gal可誘導細胞發生凋亡［4］、自噬［5］、炎癥反應［6］。最近有研究發現，緩解鐵死亡可能會部分逆轉D-gal 誘導的聽覺皮層神經變性［7］，但D-gal誘導的心肌細胞衰老是否發生鐵死亡尚不明確。Ferrostatin-1是一種鐵死亡抑制劑，可抑制心肌細胞氧化應激損傷而發揮抗氧化功能［8］。研究表明Ferrostatin-1 可抑制心肌缺血再灌注損傷、心肌肥大、心力衰竭、心肌病等多種心血管疾病［9］。此外，炎癥反應可以促進心肌衰老［10］，而鐵死亡與炎癥反應密切相關，受外部微生物影響的細胞釋放損傷相關的分子模式，細胞死亡被放大，并促進一系列與炎癥相關的反應，使用鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1可以抑制感染性和無菌性炎癥反應［11］。因此，推測Ferrostatin-1能夠改善心肌衰老。本研究旨在探討抑制鐵死亡是否可延緩D-gal 誘導的心肌細胞衰老。

1 材料與方法

1.1 材料 H9C2心肌細胞（2-1，Procell CL-0089）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。D-gal、β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自廣州賽國生物科技有限公司；Ferrostatin-1購自美國Sigma公司；兔抗鼠溶質載體家族7成員11（SLC7A11）、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPx4）單克隆抗體購自英國Abcam公司；兔抗鼠P53、GAPDH 多克隆抗體及山羊抗兔二抗購自武漢三鷹公司；培養基、血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗、PBS均購自以色列Biological Industries 公司；活性氧（ROS）測試盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。細胞培養箱、酶標儀購自美國Thermo Scientific 公司；倒置顯微鏡購自日本Nikon公司；熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司；化學發光成像系統FluorChem E購自美國ProteinSimple公司；超聲破細胞粉碎機購自寧波新藝超聲設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細胞活力 將H9C2心肌細胞種植培養于96 孔板中，每孔鋪板細胞為5 000 個。使用0、5、10、20、40、80、100 g/L的D-gal處理細胞24 h，誘導H9C2心肌細胞損傷，制備心臟衰老模型。棄去培養液，96孔板每孔加入90 μL不含血清的培養基和10 μL MTT 溶液（5 g/L，即0．5%MTT），培養箱孵育4 h后棄去培養基，每孔加入100 μL二甲基亞砜于37 ℃溫箱孵育10 min 后用490 nm 酶標儀檢測光密度（OD）值，確定后續實驗采用的D-gal質量濃度。

1.2.2 細胞培養及分組 H9C2細胞復蘇后，在裝有完全培養基（10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗和89%高糖DMEM）的培養瓶中于37 ℃含5%CO2的培養箱中培養。取對數生長期的H9C2心肌細胞，Control組完全培養基處理24 h，Dgal組用20 g/L D-gal（D-gal溶于完全培養基中）處理24 h；Fer-1組在應用20 g/L D-gal的基礎上再用10 μmol/L Ferrostatin-1處理24 h。分組后檢測各組細胞活力，方法同1.2.1。

1.2.3 DCFH-DA 法檢測細胞內ROS 水平 各組H9C2 細胞以5×104個/孔種植于六孔板，經過相應處理后棄培養基，加入含DCFH-DA探針的無血清培養基（DCFH-DA為5 μmol/L，稀釋于無血清培養基）后37 ℃孵育細胞20 min，吸去培養基，PBS洗滌2次后加入1 mL PBS于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強度。

1.2.4 微板法檢測細胞內GSH含量 收集不少于1×106個細胞，首先用PBS 清洗細胞2 次（PBS 重懸細胞，600 r/min 離心10 min），加入試劑一重懸細胞，反復凍融2～3 次，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明書操作后于412 nm波長處檢測OD 值，根據標曲線計算出樣本濃度。按細胞數量計算GSH含量（μg/106cell）=樣本濃度÷細胞數量。

1.2.5 硫代巴比妥酸（TBA）法檢測細胞內MDA 含量 超聲破碎的細胞樣本放置測定管中，與空白管、標準管在95 ℃水浴40 min后取出冷卻，然后3 500～4 000 r/min離心10 min，取200 μL 上清液于96 孔板，532 nm 處測各管OD 值。MDA 含量=（測定OD 值-空白OD 值）÷（標準OD 值-空白OD 值）×標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度。

1.2.6 Western blot 檢測細胞內SLC7A11、GPx4、P53 蛋白表達 加蛋白酶抑制劑和裂解液以1∶100 的比例裂解細胞，BCA 檢測細胞蛋白水平。以1 g/L 的蛋白電泳及轉膜，5%的BSA 常溫封閉2 h，4 ℃一抗SLC7A11（1∶10 000）、GPx4（1∶10 000）、P53（1∶3 000）、GAPDH（1∶5 000）孵育條帶過夜。第2 天TBST 洗膜3 次，每次10 min，二抗（1∶3 000）常溫孵育1 h，TBST洗膜3次（10 min/次），ECL顯色。通過Image J軟件分析各個條帶吸光度后進行相對定量。

1.2.7 微量法檢測細胞內β-GAL 活性 收集細胞后棄上清液，按照每5×106個細胞加入1 mL提取液，超聲波破碎細胞（冰浴，功率200 W，超聲3 s，間隔10 s，重復30次），15 000 r/min，4 ℃，離心20 min，取上清液后酶標儀檢測OD值。按細胞數量計算β-GAL 活力（U/104cell）=（y×V反總）÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0．028×y（y：樣本生成的產物量；V反總：反應體系總體積；V樣：加入反應體系中樣本體積；V樣總：加入提取液體積；T：反應時間）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23．0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。以P＜0．05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 D-gal處理對H9C2細胞活力的影響 0、5、10、20、40、80、100 g/L D-gal 處理細胞活力（%）分別為100．00、82．36±2．44、79．09±1．34、72．92±1．61、56．37±0．89、16．37±0．46、5．19±0．75，細胞活力隨D-gal質量濃度升高而降低（n=3，F=2 215．514，P＜0．05）。20 g/L D-gal 可使細胞活力降低至70%左右，D-gal 質量濃度≥40 g/L 時，細胞活力明顯下降，后續實驗采用20 g/L D-gal作用24 h處理細胞。

2.2 Ferrostatin-1 對D-gal 誘導的心肌細胞活力影響 Control 組、D-gal 組和Fer-1 組的細胞活力（%）分別為100．00、74．06±2．17、84．29±1．85，組間比較差異有統計學意義（n=4，F=251．415，P＜0．05）。與Control 組比較，D-gal 組的細胞活力降低；與D-gal組相比，Fer-1組的細胞活力增加（P＜0．05）。

2.3 D-gal和Ferrostatin-1對心肌細胞內ROS、MDA和GSH 的影響 與Control 組相比，D-gal 組ROS、MDA 含量升高，GSH 含量降低（P＜0．05）；與D-gal組相比，Fer-1 組ROS、MDA 含量降低，GSH 含量升高（P＜0．05），見圖1、表1。

Fig．1 The effect of D-gal and Fer-1 on ROS of H9C2 cells(×100)圖1 D-gal和Fer-1對H9C2細胞內ROS的影響（×100）

Tab.1 Comparison of ROS,GSH and MDA contents between the three groups表1 各組ROS、GSH、MDA含量比較（n=3，±s）

Tab.1 Comparison of ROS,GSH and MDA contents between the three groups表1 各組ROS、GSH、MDA含量比較（n=3，±s）

＊P＜0．05；＊＊P＜0．01；a 與Control 組比較；b 與D-gal 組比較，P＜0．05；表2同。

組別Control組D-gal組Fer-1組F ROS 15．24±1．65 39．90±4．83a 26．50±2．66b 41．345＊＊GSH（μg/106 cell）86．01±5．73 63．06±10．98a 82．59±3．28b 8．408＊MDA（nmol/mg prot）0．58±0．05 1．46±0．15a 0．94±0．05b 67．163＊＊

2.4 D-gal 和Ferrostatin-1 對心肌細胞內SLC7A11、P53、GPx4 蛋白水平的影響 相比Control 組，D-gal組SLC7A11、GPx4蛋白表達水平降低，P53蛋白表達水平升高；與D-gal 組相比，Fer-1 組的SLC7A11、GPx4 蛋白表達水平升高，P53 蛋白表達水平降低（P＜0．05），見圖2、表2。

Fig．2 The effects of D-gal and Fer-1 on protein expression levels ofSLC7A11,GPx4 and P53 in H9C2 cells圖2 D-gal和Fer-1對H9C2細胞內P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達的影響

2.5 D-gal 和Ferrostatin-1 對心肌細胞中β-GAL 活性影響 Control組、D-gal組和Fer-1組的β-GAL活性（U/104cell）分別為0．78±0．01、0．98±0．01 和0．90±0．01，組間比較差異有統計學意義（n=3，F=460．667，P＜0．05）。與Control 組相比，D-gal 組β-GAL 活性增強；與D-gal 組相比，Fer-1 組中β-GAL 活性減弱（P＜0．05）。

Tab.2 Comparison of protein expression levels of P53,SLC7A11 and GPx4 between the three groups表2 各組的P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of protein expression levels of P53,SLC7A11 and GPx4 between the three groups表2 各組的P53、SLC7A11、GPx4蛋白表達水平比較（n=3，±s）

組別Control組D-gal組Fer-1組F SLC7A11 1．04±0．18 0．48±0．09a 0．79±0．12b 12．706＊＊GPx4 1．03±0．18 0．67±0．12a 0．98±0．07b 6．730＊P53 0．69±0．35 1．13±0．05a 0．88±0．04b 92．479＊＊

3 討論

氧化應激損傷被認為是心肌衰老過程中的重要機制。細胞發生氧化應激損傷時，細胞內產生大量的ROS和脂質過氧化物破壞線粒體DNA，損傷的線粒體和線粒體功能障礙加速心肌細胞衰老［12］。另一方面，心肌細胞內過度的ROS可以阻斷自噬，導致細胞內有缺陷的線粒體和脂褐素累積［13］,自噬減少會加速心肌細胞衰老過程，增強的自噬可以減少心肌細胞衰老并延長壽命［14］。心肌細胞衰老是年齡相關性心血管疾病重要危險因素［15］。人體衰老過程中，心肌肥厚、進行性心肌纖維化、左心室壁增厚、心臟收縮和舒張異常、心臟重塑等因素導致心功能下降［16］。在心力衰竭、心肌肥厚和動脈粥樣硬化等心血管疾病中，心肌細胞衰老呈現增加趨勢［17-18］。通過延緩心肌細胞衰老來達到改善心血管疾病的目的具有重要意義。

D-gal是一種常用的誘導心肌細胞衰老的藥物。D-gal 既能通過增加心肌細胞內氧化應激水平和破壞線粒體完整性加速心肌細胞衰老［19］,也能通過氧化應激誘導的凋亡途徑和促炎作用導致心肌細胞發生損傷。本研究通過給予不同劑量的D-gal 作用24 h，篩選出20 g/L D-gal 誘導心肌衰老模型，結果表明，D-gal 作用H9C2 細胞24 h 后，H9C2 細胞出現氧化應激損傷，表現為細胞活力降低，ROS 和MDA產生增加。β-GAL活性和P53水平可間接反映細胞衰老狀態，P53 的激活會導致線粒體損傷［20］。本研究中，D-gal作用H9C2細胞24 h后，H9C2細胞內β-GAL活性增強和P53蛋白表達水平增加，提示D-gal誘導的心肌細胞衰老模型構建成功。

鐵死亡是一種細胞內ROS 誘導的、細胞膜上磷脂成分發生過氧化反應從而破壞細胞膜最終導致細胞死亡的一種新型細胞死亡形式，這一概念首先由Dixon 等［21］提出。鐵死亡在生物化學上主要表現為脂質過氧化物堆積及抗過氧化物質減少，如ROS 產生增加和GSH、GPx4 減少等［22］。GPx4 以GSH 為底物使脂質過氧化中間體脂質氫過氧化物轉化為脂質醇，從而抑制過氧化物的堆積。研究表明，GSH減少引起的脂質過氧化可以導致鐵死亡，GPx4和GSH在脂質過氧化和鐵死亡中發揮重要作用［23-24］。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸轉運體中的輕鏈，主要發揮轉運胱氨酸的作用，進入胞內的胱氨酸通過一系列反應合成GSH，受SLC7A11 調控的GPx4 以GSH為底物清除過氧化物從而影響細胞鐵死亡的進程，研究表明Ferrostatin-1 通過促進支氣管上皮細胞中SLC7A11 的表達和增強GPx4 的活性從而抑制鐵死亡的發生［25］。因此，SLC7A11和GPx4可以作為鐵死亡蛋白標志物。本研究中D-gal 的應用使心肌細胞中GSH含量減少，ROS和MDA產生增多，SLC7A11、GPx4表達降低，表明D-gal可以誘導H9C2心肌細胞發生鐵死亡。通過使用Ferrostatin-1 對H9C2 細胞處理進一步探索D-gal 誘導的鐵死亡及心肌細胞衰老機制。研究結果顯示，Ferrostatin-1 可以增強因D-gal而降低的細胞活力,增加細胞內GSH的含量和SLC7A11、GPx4蛋白水平，減少ROS和MDA的含量。已有研究顯示，D-gal 可以誘導PC12 神經細胞發生鐵死亡，而鐵螯合劑DFO 可以抑制D-gal 誘導的鐵死亡和延緩神經退行性改變［7］，與本研究D-gal誘導H9C2心肌細胞發生鐵死亡結果相似。

抑制鐵死亡可作為抗衰老治療靶點［26］。既往研究表明，GSH 耗竭和鐵死亡誘導劑Erastin 可阻止視網膜色素上皮細胞生長并誘導細胞早衰［23］，通過抑制脂質過氧化或限制鐵潴留來阻斷鐵死亡，可以減輕與年齡相關的腸細胞死亡，延長秀麗隱桿線蟲的壽命［27］。鐵死亡已被發現參與與年齡相關的心血管疾病、神經退行性疾病［28］，而SLC7A11 過表達可以逆轉肺成纖維細胞衰老相關表型［29］。本研究發現，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 可以降低因D-gal 而增強的β-GAL活性和P53蛋白水平，表明Ferrostatin-1可以延緩D-gal誘導的H9C2細胞衰老。

綜上，本研究表明鐵死亡參與了D-gal 誘導的H9C2 細胞衰老，而Ferrostatin-1 可以抑制鐵死亡從而延緩D-gal 誘導的H9C2細胞衰老，本研究為心肌衰老機制及治療提供了另一視角。