替莫唑胺對膠質母細胞瘤基因表達譜影響的研究*

魏志豪 劉洪超 史康克 張 雨 李佳瓊

河南科技大學教學醫院 洛陽新區人民醫院病理科，河南省洛陽市 471023

膠質母細胞瘤(Glioblastoma，GBM)是人類最常見的原發性惡性腦腫瘤，以腫瘤細胞呈浸潤性生長為主要特征，進展迅速。近年來雖然手術、放化療技術得到了長足發展，但GBM患者的預后仍沒有明顯改善，其5年生存率不足10%[1]。替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)是目前治療GBM的一線化療藥物。TMZ是一種新型口服烷化劑類抗腫瘤藥物，其優點是具有較寬的抗腫瘤譜、易于透過血腦屏障、與其他藥物沒有疊加毒性等。目前認為DNA甲基化和錯配修復失敗是TMZ細胞毒性的主要機制[2]。然而臨床研究表明TMZ對GBM的治療有效率卻只有45%左右，腦膠質瘤對TMZ產生耐藥性是導致化療失敗的最主要原因[3-4]。本研究從基因表達公共數據庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中下載TMZ處理裸鼠顱內移植瘤的芯片數據并進行生物信息學分析，探索TMZ對膠質母細胞瘤基因表達譜的影響，為深入研究TMZ細胞毒性機制和耐藥機制提供參考依據，為膠質瘤的治療提供有效的新方案。

1 材料與方法

1.1 材料 數據來源：從GEO數據庫中下載表達譜數據集GSE47809，該數據集共包含7個樣品，其中4個為TMZ處理組腦腫瘤組織，其余3個是未處理組腦腫瘤組織。

實驗方案：先采用干細胞培養液(神經培養基中加入B27添加物、30ng/ml表皮生長因子和30ng/ml堿性成纖維細胞生長因子)培養膠質母細胞瘤神經球(Glio6)，然后利用立體定向注射法將體外培養的神經球(含5×105細胞)注入雌性裸鼠右側尾狀核，構建裸鼠顱內移植瘤模型。細胞移植后45d，其中4只裸鼠灌胃給予TMZ，其余3只裸鼠灌胃給予等體積溶媒，連續5d。細胞移植后75d，切除腦部腫瘤組織，采用MirVana分離試劑盒提取總RNA，進行基因轉錄譜檢測。芯片檢測平臺為GPL570平臺，即Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 差異表達基因篩選 將GSE47809數據文件導入GEO2R在線工具，定義實驗組和對照組。GEO2R首先采用GEOquery R軟件包將GEO數據解析成R數據結構，然后運用limma軟件包統計每個基因的統計學顯著水平[5]。差異表達基因(Differentially expressed genes，DEGs)的篩選條件為：P<0.05，組別差異倍數≥2倍。

1.3 基因本體富集分析 基因本體(Gene Ontology，GO)是國際標準化的基因功能分類系統，對基因和蛋白質的功能進行限定和描述。本研究把篩選出的差異基因向GO數據庫映射，計算出每個條目對應的基因數目，利用Fisher精確檢驗統計富集水平，并采用Benjamini-Hochberg方法控制錯誤發現率(False discovery rate，FDR)，顯著富集GO條目的標準為P<0.05，FDR<0.05。

1.4 通路富集分析 本研究基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)數據庫，采用Fisher檢驗統計DEGs在各個通路中的富集程度，以P<0.05為閾值篩選與整個基因組背景相比，在差異基因中顯著性富集的信號通路。

1.5 互作網絡構建 對輸入的差異表達譜數據，計算出各基因間的相關系數矩陣，借鑒數據所具有的無標度性質，通過基因間的相關系數擬合基因的無標度網絡關系。另外以通路為單位，運用圖論的方法將顯著性通路基于KEGG數據庫中的相互作用關系構建通路互作網絡，分析顯著富集通路之間的傳導關系[6]。

2 結果

2.1 差異基因篩選結果 以未給予TMZ處理的顱內移植瘤組織作為對照組，給予TMZ處理的移植瘤組織作為實驗組，根據篩選條件P<0.05，差異倍數≥2倍，共篩選出1 936個DGEs，其中上調基因1 031個，下調基因905個，部分差異基因如表1所示。

表1 部分差異表達基因列表

2.2 GO功能富集分析 對差異基因進行GO功能注釋后發現，顯著富集的分子功能主要集中于蛋白結合、ATP結合、轉錄因子活性、細胞骨架結合、蛋白激酶活性、DNA結合、金屬離子結合等；顯著富集的生物學過程主要包括信號轉導、轉錄調控、軸突導向、細胞凋亡調控、細胞黏附、細胞周期停滯和DNA復制等，富集水平最顯著的前20個條目列于表2。

表2 差異基因基因本體富集分析

2.3 通路富集分析 將差異基因向KEGG數據庫映射，結果發現腫瘤通路、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)-Akt信號通路、細胞骨架調節、細胞周期、Hippo信號通路、P53通路等79個通路顯著富集，富集水平最顯著的前20個列于表3。

2.4 互作網絡分析結果 基于KEGG數據庫中信號通路的上下游關系，構建顯著富集通路之間的相互作用關系網絡圖如圖1所示，圓點大小代表degree值，圓點越大，在網絡中的作用越重要。由通路互作網絡圖可知，核心通路包括MAPK信號通路(degree=27)、細胞凋亡(degree=21)、腫瘤通路(degree=19)和細胞周期(degree=18)。另外基因共表達網絡篩選出的核心基因包括PI3KCD、AKT3、表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白磷酸酶1催化亞基β(PPP1CB)、磷脂酰肌醇5-激酶1α(PIP5K1A)、輔肌動蛋白α1(ACTN1)。

3 討論

TMZ細胞毒性被認為是對DNA的甲基化，甲基化主要發生在鳥嘌呤的N7和O6位置上。DNA復制過程中，錯配修復系統雖能識別錯誤配對的堿基對，但不能為O6-甲基鳥嘌呤找到配對堿基，導致子鏈DNA缺口形成。缺口隨細胞分裂而逐漸積累，最終阻礙復制啟動，從而使細胞停滯在G2/M期進而發生凋亡。O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)能與鳥嘌呤6位氧上的烷基化合物結合，將烷基轉移到MGMT第145號半胱胺酸活性位上，使烷基化的鳥嘌呤被還原，錯配修復途徑的蛋白復合物因缺陷而導致不能識別錯配，從而使細胞容忍甲基化存在，避免子鏈DNA缺口出現，導致TMZ耐藥性[7]。越來越多的研究發現，腦膠質瘤產生TMZ耐藥性不是由單一因素影響導致的，主要包括DNA損傷修復，促癌基因表達，化療藥物刺激后機體應激反應等方面[8-9]。

表3 差異基因通路富集分析

圖1 通路相互作用網絡分析

本研究對TMZ處理組和未處理組腦腫瘤組織的表達譜進行分析，共篩選出1 936個差異基因，富集分析表明這些差異基因主要涉及轉錄調控、信號轉導、細胞凋亡調控、細胞黏附、細胞周期停滯和DNA復制等生物過程，參與MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞骨架調節、細胞周期、P53信號通路等。TMZ處理后GBM組織中PIK3CD、AKT3等基因表達下調，EGFR、PPP1CB、ACTN1等基因表達上調，引起代謝通路和信號通路變化，阻滯DNA復制和細胞周期進程并誘導其凋亡。網絡分析挖掘出的核心基因和關鍵通路可能是TMZ抑制GBM的潛在靶點，具體分子機制有待進一步研究。

總之，替莫唑胺引起膠質母細胞瘤基因轉錄譜發生明顯改變，主要涉及細胞周期阻滯、凋亡誘導、MAPK信號通路、細胞侵襲和轉移等生物過程和信號通路，為深入研究TMZ細胞毒性機制和耐藥機制提供了參考，也為指導臨床個體化應用以及開發新型靶向治療提供基礎。