恥垢分枝桿菌精氨酸代謝變化對細菌毒力及肺上皮細胞線粒體功能的影響

周紫薇，林 晨，李燁雨，王玉臣，張 鷺

（復旦大學生命科學學院遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438）

20世紀90年代初，全球結核病疫情開始呈現出上升趨勢，特別是結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和人類免疫缺陷病毒共感染、耐藥、耐多藥（multi-drug resistance，MDR）和廣泛耐藥（extensively-drug resistance，XDR）菌株的不斷出現，使結核病成為世界范圍內的公共衛生問題。2019年，全球約有1 000萬人患上結核病，其中約有140萬例結核病患者死亡，因MDR結核病死亡的患者約18.2萬例[1]。作為胞內致病菌，MTB與宿主細胞的相互適應及調控機制，是值得關注的重要科學問題。

精氨酸不僅是細菌蛋白質合成中重要的氨基酸，還可以作為細菌生長的唯一氮源，甚至是碳源和能量來源[2]，它是合成多胺的底物，對細菌的極端耐酸能力非常重要。此外，精氨酸胍基參與多種生命活動，涉及許多調節和組織特征的復雜相互作用，包括與蛋白質和核酸的相互作用，對細菌的生理和致病性有重要影響，了解精氨酸代謝對于病原和宿主的影響有重要意義。精氨酸從頭合成通路受到破壞會使細胞內精氨酸供應不足，中間產物和活性氧積累，并發揮快速殺菌的作用[3]，這個合成通路涉及多種酶的作用，相應編碼基因構成ARG box，位于argC上游啟動子區域；抑制性轉錄調控因子ArgR可在精氨酸存在的情況下與ARG box結合，抑制該通路的轉錄。

恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis，M.smeg）與MTB的同源基因超過2 000個，具有較MTB更為廣泛的天然耐藥譜，迄今為止，唯一獲批的抗結核新藥苯達奎林就是以M.smeg作為模式菌株進行篩選而確證的[4]。MTB中的11個雙組分系統和5個組蛋白激酶（共7個）均與M.smeg具有高度同源性，缺氧持留下的相關基因也在M.smeg中被找到[5]。因此，M.smeg不僅可以作為篩選抗菌藥物的良好模型，還是研究MTB基因表達和病原宿主互作的良好模式菌株。本研究中的精氨酸代謝途徑已被證明在細菌中相對保守[6]，分析精氨酸在M.smeg中的代謝途徑，有助于對致病性MTB中精氨酸代謝特征的解析。肺泡上皮細胞是分枝桿菌入侵宿主細胞的第一道防線，分枝桿菌感染人類Ⅱ型肺上皮細胞的能力已被證實[7]，其在人非小細胞肺癌細胞系A549中的增殖率比其他細胞高15～20倍[8]，且具有一定的胞間播散能力[9-10]。已有研究發現，巨噬細胞感染過程中，M.smeg可以通過感染A549細胞轉化為致病表型[11]。因此，本研究選擇A549細胞作為模式細胞株，初步探索分枝桿菌精氨酸代謝變化對細菌-宿主相互作用的影響。

1 材料和方法

1.1 菌株和載體

大腸埃希菌（Escherichia coli） Trans 5α感受態菌株（北京全式金生物技術有限公司）；恥垢分枝桿菌（M.smeg MC2155）野生型菌株（本課題組保存）；pCR-Hyg質粒、pJV53-Cpf1質粒（中國醫學科學院北京協和醫學院結核病研究中心惠贈）；A549細胞（本實驗室留存）。

1.2 實驗試劑和培養基

細菌基因組小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）清潔試劑盒（美國Axygen公司）；逆轉錄試劑盒（日本TaKaRa公司）；Talent熒光定量試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]；7H9液體培養基、7H10固體培養基（美國BD公司）。

1.3 M.smeg argR的敲除及驗證

參考文獻[12]，利用Crispr技術構建argR敲除的M.smeg。RNA抽提：從-80 ℃冰箱中取出保存的細菌，在7H10平板上進行劃線，37 ℃培養48 h后，挑取生長良好的單個菌落，37 ℃搖床培養至對數中期[600 nm處吸光度（A）值為0.8～1.0]，1∶1 000接種至3 mL無抗7H9（含0.2%甘油、0.05%Tween-80和10%OADC）中，待其生長至對數中期，1 800×g離心10 min收取菌體，采用Trizol法抽提RNA。采用分光光度計（德國Eppendorf公司）定量，并使用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄。逆轉錄得到的cDNA采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進行驗證。精氨酸代謝相關基因引物序列見表1。

表1 精氨酸代謝相關基因引物序列

1.4 細菌體外生長

將野生型mc2155M.smeg（WT）以及argR敲除的M.smeg突變株（ΔargR）在7H9培養基（含有0.05%Tween-80和10%ADC）中37 ℃過夜培養后，分別稀釋至不含0.2%甘油和含0.2%甘油的7H9培養基（含有0.05%Tween-80）中，使A600nm值為0.05，37 ℃搖床培養。經預實驗測定細菌生長曲線后，選取對數前期、對數中期、對數后期、穩定期菌液測量A600nm值。

1.5 細菌脂類代謝相關基因

嚴格按試劑盒要求，采用RT-qPCR對脂肪酸代謝相關基因進行驗證。M.smeg脂類代謝相關基因及引物見表2。

表2 M.smeg脂類代謝相關基因及引物

1.6 細胞侵染

復蘇A549細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養，傳代2次后，稀釋至1×105個/mL，按每孔1 mL加至24孔板內，37 ℃培養24 h，使其完全貼壁。WT和ΔargR在7H9培養基（含0.2%甘油、0.05%Tween-80和10% OADC）中37 ℃過夜培養至A600nm值為0.8～1.0，取適量菌液1 800×g離心10 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，使用含10%胎牛血清的DMEM稀釋至MOI為25進行侵染，2 h后棄去細胞培養液，貼壁緩緩加入等體積磷酸鹽緩沖液，輕晃平皿后棄去，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后加入1 mL 0.1%Triton-X100，37 ℃孵育15 min，用1 mL槍頭充分吹洗平皿，吹打混勻使細胞充分裂解，轉移至1.5 mL Eppendorf管，用磷酸鹽緩沖液（含0.05% Tween-80）稀釋涂板。

1.7 CCK8細胞活力檢測

按照上述細胞侵染條件在96孔板侵染CCK8細胞，分別于浸染2、18、24、48 h后測定細胞活力。吸凈原培養基，換用新的DMEM完全培養基100 μL，迅速用排槍加入10 μL CCK8試劑，避免產生氣泡，用搖板輕輕混勻，37 ℃培養箱避光孵育40 min，檢測A450nm值。細胞活力（%）=[A（實驗組）-A（空白）]/[A（對照組）-A（空白）]×100%。

1.8 細胞線粒體功能相關基因檢測

嚴格按逆轉錄試劑盒要求，采用RT-qPCR對細胞線粒體功能相關基因UCP1、DNM1L進行驗證。引物序列見表3。

表3 細胞線粒體功能相關基因及引物

1.9 統計學方法

采用GraphPad prism 8.0.2軟件進行統計分析。兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用雙因素方差分析（Two-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 M.smeg argR的敲除及驗證

利用Crispr技術成功將第34和第35個氨基酸突變為終止密碼子UAA，獲得argR敲除菌株。argR敲除菌株內部2個連續的密碼子被突變為2個終止密碼子，但仍能夠轉錄，因在RNA水平無法檢測，故根據文獻[12]的標準，測序結果符合實驗設計要求即可判定敲除成功。分枝桿菌中位于argC起始位點的ARG box受轉錄調控因子ArgR的抑制。野生型M.smeg中，因為argR的表達，相關效應基因argB、argC、argD和argF表達受到抑制。為了從調控功能角度進一步驗證ΔargR菌株中的argR表達缺陷，我們針對ARG box的效應基因設計RT-qPCR引物，檢測相關基因的表達水平，結果見圖1（argD由于表達量較低，無法檢測，圖中未展示）。argR表達缺陷的ΔargR菌株中，ARG box中效應基因的表達抑制作用被解除，argB、argC、argJ和argF轉錄水平均明顯上調表達，從遺傳調控功能角度驗證突變株構建成功。

圖1 Arg從頭合成通路組成基因表達轉錄水平驗證結果

2.2 細菌體外生長

細菌生長曲線見圖2（a）；在僅以葡萄糖為碳源的培養基中，ΔargR的生長情況優于野生型，見圖2（b）；在以甘油和葡萄糖為碳源的培養基中，ΔargR的生長優勢被中和，與WT趨于一致，見圖2（c）。

圖2 含有不同營養成分的7H9中M.smeg生長情況

2.3 細菌脂類代謝相關基因檢測

RT-qPCR結果顯示，脂類分解代謝相關基因（fadD21、fadD2、fadD9和fadA5）均顯著下調。脂滴形成相關基因MSMEG_2695（MTB編號為Rv2744c）顯著下調，分枝菌酸合成上調。見圖3。

圖3 細菌脂類代謝相關基因表達變化

2.4 細菌入胞率及細胞活力

ΔargR入胞率高于WT，ΔargR侵染使得細胞活力顯著下降，在2 h時即有顯著差異。見圖4。

圖4 ΔargR入胞率及細胞活力

2.5 細胞線粒體功能相關基因表達變化

RT-qPCR結果顯示，細胞線粒體功能相關基因UCP1和DNM1L表達量均顯著下調。見圖5。

圖5 細胞線粒體功能相關基因表達變化

3 討論

結核病難診斷、難治療、預后差，耐藥結核更是給結核病的防治帶來了巨大挑戰。結核菌具有隨宿主不斷進化的獨特免疫逃逸機制。精氨酸在病原與宿主生理及代謝中都發揮著關鍵作用，其對于分枝桿菌毒力及致病性的影響值得關注。

有研究結果顯示，MTB的fadD2和fadA5對環境脂質含量的變化十分敏感，在以葡萄糖為主要碳源和以膽固醇與脂肪酸為主要碳源的培養基中生長表達情況變化顯著，在富脂環境中因應激表達顯著上調，并上調脂肪酸分解代謝[13]。當MTB在以丁酸為唯一碳源的培養基中生長時，fadD9表達上調，以增加對脂肪酸的分解和利用[14]，突變株的脂類分解代謝相關基因均顯著下調。此外，MSMEG_2695（MTB編號為Rv2744c）敲除可以使M.smeg中脂滴數量增加，且變得大而透亮，MSMEG_2695在突變株中的下調與細菌脂類分解代謝下調和文獻[15]結果一致。

線粒體是真核細胞維持生命活動和代謝調控的重要細胞器，能夠為絕大多數細胞信號通路提供能量[16]。同時，線粒體是高度動態變化的細胞器，可以不斷地重塑其結構，特別是其形成分布在很大程度上是通過線粒體分裂、融合、運動和系結等保守活動來維持的[17]，這一過程受到多個通路的調控，極易受到外在環境的影響。有研究發現，線粒體是控制多種疾病進程的關鍵因子，已經成為一些細菌和病毒病原體控制宿主代謝以達到在感染過程中生存、復制和播散的靶標[18]。因此，基于CCK8檢測細胞活力的原理，本研究選擇線粒體功能相關基因進行轉錄水平定量分析，定量結果顯示，線粒體脂肪酸代謝下調，分裂受到抑制。提示線粒體功能受損是ΔargR導致的細胞活力下調的原因之一，但具體機制還有待進一步探索。

綜上所述，分枝桿菌argR的敲除使得細菌精氨酸合成代謝上調，細菌脂質儲存能力提高有利于細菌在營養相對不足的環境中長期生存，特別是作為胞內菌，這種能力可能有利于分枝桿菌應對宿主細胞內的營養限制壓力；此外，細菌侵染上皮細胞A549的能力提高，分枝菌酸合成上調，而分枝菌酸是分枝桿菌細胞壁的一個重要毒力因子，提示其毒力可能增強，更有利于細菌對宿主細胞的侵染；本研究進一步分析了宿主細胞侵染后的生理現象，發現ΔargR菌株可以干擾宿主細胞線粒體功能，抑制其脂類代謝活性及線粒體分裂過程，是細胞活力下降的原因之一。

精氨酸代謝變化不僅對分枝桿菌的生理及代謝產生重要影響，還進一步影響宿主細胞的生命活動，尤其包含了對細胞線粒體功能的干擾，結合線粒體的關鍵作用，本研究從病原菌和宿主細胞角度揭示了分枝桿菌精氨酸代謝對細菌毒力的重要影響，對探究感染過程中宿主與病原相互作用關系、尋找藥物靶點有積極意義。