抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素的含量測定及風險評估*

薛 平，陳雨蕉，胡金云，李 莉

常州市食品藥品纖維質量監督檢驗中心，常州213000

抗栓膠囊具有活血化瘀、抗栓通脈之功效；多用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡證。其由當歸尾、水蛭、土鱉蟲、丹參、烏梢蛇、麝香、馬錢子、骨碎補、僵蠶、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味藥材制成，對腦血栓、心肌梗塞、血栓性靜脈炎等有較好的輔助治療效果[1]。

目前抗栓膠囊質量控制研究主要集中于丹參酮ⅡA等成分的含量測定，針對土鱉蟲進行的黃曲霉毒素限量安全控制，其他方面的質量控制研究較少[2]。目前中藥外源性有害物質的安全性監控是中藥質量控制重點之一，外源性有害物質主要包括重金屬及有害元素、農藥殘留和真菌毒素等[3]。作為生粉直接入藥的抗栓膠囊，可能存在一定程度的重金屬及有害元素安全風險。本研究采用電感耦合等離子體質譜法測定抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 的含量[3，4]，考察不同生產企業的抗栓膠囊中重金屬有害元素概況，為該藥的質量控制和安全性評價提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

電感耦合等離子質譜儀（ICP Q，美國賽默飛世爾科技有限公司）；微波消解儀（CEM mars 5 express 美國培安有限公司）；XP105DU 萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 試藥與樣品

9 種單元素標準溶液：釩（V，批號20041435）、鈷（Co，批號20041435），鎳（Ni，批號20041435）、砷（As，批號20050635）、鎘（Cd，批 號20050635）、汞（Hg，批號20050635）、鉛（Pb，批號20050635），濃度均為100 μg·mL-1，銅（Cu，批號20082535，濃度1000 μg·mL-1），均購自于鋼研納克檢測技術股份公司；鉻（Cr，批號B2006161，濃度為100 μg·mL-1）購自于壇墨質檢標準物質中心。

內標元素：鈧（Sc，批號19090235，濃度100 μg·mL-1），鍺（Ge，批號20092745，濃度1000 μg·mL-1），銦（In，批號19092985，濃度100 μg·mL-1），鉍（Bi，批號20032635，濃度100 μg·mL-1）均購于鋼研納克檢測技術股份公司。

金單元素標準溶液（Au，批號20071635，濃度100 μg·mL-1）購自于鋼研納克檢測技術股份公司；65%硝酸為優級純；水為去離子水。

抗栓膠囊樣品涵蓋全國20 個省級行政區，共涉及9 家生產企業（編號A-I），共29 批次樣品。

2 方法[5，6]

2.1 ICP-MS 儀器測定方法

射頻功率：1550 W；蠕動泵：40 r·min-1；冷卻氣流量：14 L·min-1；載氣補償氣流速：0.8 L·min-1；霧化氣流量：0.9021 L·min-1；霧化室溫度：2.7 ℃；碰撞氣體：氦；碰撞氣流速：4.98 mL·min-1；采樣深度：5.00 mm；延遲時間30 s；積分時間5.8 s，掃描次數：15 次。

測定時選取的同位素為51V、52Cr、60Ni、63Cu、75As、114Cd、202Hg、208Pb，其中51V、52Cr 以45Sc 作為內標，60Ni、63Cu、75As 以72Ge 作為內標，114Cd 以115In 作為內標，202Hg、208Pb 以209Bi 作為內標，通過蠕動泵在線加入內標溶液，測定時儀器的內標管始終插入內標溶液中，樣品管按要求放入相應的溶液中進行測定，取3 次讀數的平均值計算。在儀器的數據分析軟件中，將內標法設置為在線內標實時校正，即數據采集點的信號以實時內標點的信號進行校正。各個元素以內標校正的信號值（cps）為縱坐標，相應的質量濃度（ng·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。按儀器數據分析軟件的要求，設置相關參數，得到各元素的標準曲線、供試品溶液中各元素的濃度。根據各元素的濃度值計算樣品中待測元素的含量。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品貯備液 分別精密量取V、Cr、Co、Ni、Cu、As、Cd、Hg、Pb 單元素標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 分別含V、Cr、Ni、Co均為5 μg 的溶液；每1 mL 分別含Cu、As、Cd、Hg、Pb 為100、100、1、1、100 μg 的溶液，即得。

2.2.2 內標溶液 分別精密吸取Sc、In、Bi 單元素標準溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 含Sc、In、Bi 各50 ng，含Ge 100 ng 的內標溶液。

2.2.3 供試品溶液 取抗栓膠囊樣品內容物約0.3g，精密稱定，置于耐壓耐高溫微波消解罐中，加硝酸5mL，放置過夜，密閉、消解。消解程序為在0～5min，由初始溫度升溫到120 ℃，維持2 min；在7～13 min，由120 ℃升溫到160 ℃，維持3 min；在16～20 min，由160 ℃升溫到180 ℃，維持25 min。消解完全后，消解液冷卻至60 ℃以下，取出，放冷，將消解液轉入50 mL 聚四氟乙烯量瓶中，用少量水洗滌消解罐3次，洗液合并于聚四氟乙烯量瓶中，加入金單元素溶液（1 μg·mL-1）200 μL，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。除不加樣品內容物外，同法制備空白溶液，在同樣的分析條件下進行空白試驗。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品貯備液適量，用2%硝酸溶液稀釋制成每1 mL 含V、Co、Cr、Ni 為0、0.1、1、2.5、10、20、50 ng，含Cd、Hg 為0、0.02、0.2、0.5、2、4、10 ng，含As 為0、0.6、6、15、60、120、300 ng，含Cu 為0、1、10、25、100、200、500 ng，含Pb 為0、1、10、25、100、200、500、1000 ng的系列濃度混合對照溶液。

按“2.1”項下的測定條件，依次將儀器的樣品管插入各個濃度的標準品溶液中進行測定（濃度依次遞增），各個元素以內標校正的信號值（cps）為縱坐標，相應的質量濃度（ng·mL-1）為橫坐標，繪制各元素的標準曲線。回歸方程與線性范圍見表1。

2.3.2 精密度試驗 取線性關系中標準曲線第5個濃度點的對照品溶液，按“2.1”項下檢測條件測定，測得溶液中各元素的濃度，重復測定6 次。根據測得的濃度值計算8 種元素的RSD 值，均＜5%，表明儀器精密度良好，見表1。

表1 9 種元素的線性、精密度、重復性和檢測限（表中元素分類來源于ICH Q3D）

2.3.3 重復性試驗 精密稱取樣品0.3 g（編號A），按上述“2.2.3”項下方法制備供試品溶液6 份并分析，測得供試品溶液中各元素的濃度，計算得到各元素的含量。根據各元素的含量計算RSD，8 種元素的RSD 值均＜6%，表明本方法重復性良好，見表1。

2.3.4 加樣回收率試驗 取同一批次樣品（編號A）0.3 g，精密稱取，置于聚四氟乙烯消解罐內，精密加入混合標準貯備液0.1 mL，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”項下檢測條件測定供試品溶液中各元素的濃度，計算各元素的含量，扣除樣品（編號A）中元素本底的含量，分別計算各元素的回收率、平均回收率及相對標準偏差（RSD%），結果見表2。表明本試驗準確度良好。

3 結果

3.1 樣品測定結果

取9 企業的抗栓膠囊，按“2.2.3”的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下檢測條件測得供試品溶液中各元素濃度，分別計算樣品中各元素含量。見表3。

表3 29 批樣品中元素的含量測定結果（n=2，mg·kg-1）

3.2 測定結果分析

3.2.1 指紋圖譜直觀分析 為直觀地反映測定結果，繪制了抗栓膠囊有害元素的指紋圖譜[7]。將測定的元素按原子序號排列作為橫坐標，29 批樣品的測定結果為縱坐標，繪制有害元素含量分布曲線。由指紋圖譜顯示（見圖1），樣品中有害元素含量存在一定程度的波浪式分布，其中V、Cr、Co、Ni、Cu、Cd、Hg含量相對較低，不同樣品間As 和Pb 的量存在顯著差異，其余大部分元素量的多寡順序幾乎趨于一致。

圖1 抗栓膠囊有害元素指紋圖譜

3.2.2 熱圖直觀分析 熱圖已廣泛應用于數據分析，能清晰表現數據的疏密、頻數高低和差異變化，從而彌補上述元素指紋圖譜分析的不足之處[8]。利用Image GP 網頁制圖工具將29 批樣品的測定結果繪制成熱圖（見圖2）。各元素的含量和每個元素含量的平均值相比，用藍色向紅色表示，越紅差異程度越大。圖2 結果表明，29 批樣品中Pb、Cr、Hg、As 4 種元素的含量存在顯著差異性。其中樣品中Pb 差異最為顯著，顏色呈階梯式變化。Pb 含量的高低對應顏色的變化過程大致可分為4 個梯度（由低到高）：第一梯度（H＜F2＜F1＜D＜E2＜A＜E1）呈深藍逐漸變為藍色；第二梯度（B4＜B10＜B2＜B5＜I2＜B11＜I3＜G3＜B6）由藍色逐漸變為綠色；第三梯度（C4＜C1＜B3＜B8＜I1）由綠色逐漸變為黃色；第四梯度（G1＜G2＜B7＜C3＜C5＜C2＜B9＜B1）由黃色逐漸變為紅色。熱圖中各元素的顏色差異清晰表現了樣品間含量的差異，同時熱圖中左邊企業聚類分析和上面9 種元素之間的聚類分析的情況表明，在29 批樣品中，9 種有害元素含量之間無直接明顯的相關性，不同企業、同一企業不同批次間未出現明顯的聚類現象。

圖2 9 種有害元素含量的熱圖

4 風險評估

4.1 鉛、鎘、砷、汞、銅的健康風險評估[9，10]

“中藥中外源性有害殘留物安全風險評估技術指導原則”和《中國藥典》2020 年版四部9302“中藥有害殘留物限量制定指導原則”描述了重金屬及有害元素最大限量理論值的計算方法，該值的計算依據源自于危害指數法評估中藥中重金屬的暴露量。目前該方法常被應用在Pb、Cd、As、Hg、Cu 5 種元素的健康風險評估，其他有害元素由于缺乏公認的健康指導值（A），使用頻率較低。

依據《中國藥典》2020 年版中相關規定，計算得出該制劑中鉛、鎘、砷、汞、銅的最大限量理論值。

公式1 中L 為最大限量理論值（mg·kg-1）；A 為每日允許攝入量（μg·kg-1·bw），Pb 為1.3 μg·kg-1，Cd 為0.83 μg·kg-1，As 為3.0 μg·kg-1，Hg 為0.57 μg·kg-1，Cu 為500 μg·kg-1；W為人體平均體重（kg），按63 kg 計；M 為每日人均可服用的最大劑量（kg），抗栓膠囊每日服用量為15～24 粒，每粒約0.3 g，每日最大服用量約為7.2 g（0.007 2 kg）；AT 為平均壽命天數，一般為365 天/年×70 年；EF 為中藥服用頻率（天/年），EF 為每年90 d；ED 為一生的服用中藥的暴露年限，Ed為20 年；t 為中藥經煎煮或提取后，重金屬元素的轉移率（%），中成藥t 為100%；10 為安全因子，表示每日由中藥材及其制品中攝取的重金屬量不大于日總暴露量（包括食物和飲用水）的10%。

Pb、Cd、As、Hg、Cu 的最大限量理論值（mg·kg-1）分別為16.1、10.3、37.3、7.1、6210。

通過試驗發現，29 批抗栓膠囊中有19 批Pb 的含量超出最大理論限量值，2 批As 的含量超出最大理論限量值。另外3 種元素的含量均低于各自的最大理論限量值。

由計算結果警示抗栓膠囊中Pb、As 含量可能存在一定程度的風險，應對相關元素進一步明確風險來源，探究該品種的健康風險程度。

4.2 釩、鉻、鈷、鎳的健康風險評估[4]

ICH Q3D 中對元素健康風險評估，規范嚴謹，通常將30% PDE 值的定義為控制閾值，具有較好的參考作用。ICH Q3D 中V、Cr、Co、Ni 的每日允許暴露量（PDE，μg·d-1）分別為180、19800、90、5400；抗栓膠囊每日最大服用量約為7.2 g。為方便統計，將30% PDE 值按每日最大服用量折算到相應元素的含量（控制閾值含量）。V、Cr、Co、Ni 的控制閾值含量（mg·kg-1）分別為4.2、458.3、2.1、8.3。

在29 批次樣品中，僅有一批次樣品中V 含量（6.072 mg·kg-1）超過4.2 mg·kg-1，其余3 種元素含量均低于控制閾值含量。ICH Q3D 計算模型嚴格程度極高，常用于化學藥，未充分考慮中國人生活、用藥和中成藥的實際情況，對中藥的評估往往過于嚴格。綜合考慮，相對而言，V 含量過高導致的健康風險概率仍然較低。本試驗結果表明，抗栓膠囊中V、Cr、Co、Ni 等4 種有害元素含量的健康風險相對較低。

5 討論

《中國藥典》2020 年版關于重金屬有害元素質量控制主要考察Cr、Cu、As、Cd、Hg、Pb；ICH Q3D 一般要求口服制劑考察1 類對人體有害元素和2 類給藥途徑依賴型的人體有害元素（根據出現的概率分為2A 和2B 亞類），其中2B 亞類出現概率較低。通過預實驗，綜合考慮，選取藥典、ICH Q3D 1 類和2A 亞類所有涉及的9 種重金屬有害元素。

預實驗發現，取10 粒抗栓膠囊內容物混勻，稱取內容物適量，測定有害元素含量，可能導致測定結果重復性較差。考慮到本品處方量大，重金屬及有害元素屬于痕量檢測，可能會出現不均勻的情況。合理取樣對痕量檢測結果的準確性至關重要。預實驗對比了取同一批本品內容物10、25、50、80 g，發現取樣50 g 與80 g 試驗結果重復性良好。故正式測定時以四分法取樣，每份內容物取樣量不＜50 g。

6 小 結

重金屬及有害元素是中藥外源性有害物質量控制的重點之一。以風險評估模型科學識別風險是目前進行中藥質量健康評價的主要方法。本研究考察了29 批抗栓膠囊中9 種重金屬有害元素大致概況，發現樣品中Pb 含量差異顯著，部分樣品Pb 含量較高，As 有2 批含量異常，這提示可能與企業所用原料有關，也可能與生產工藝、生產過程中清場不徹底造成了交叉污染有關。對抗栓膠囊鉛、砷含量較高的真正原因，有待進一步研究，以保證用藥安全。