白術(shù)與菊科混偽品的鑒別研究*

李子璐，余國鑫，陳 君

中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院生藥學(xué)系，南京210009

中藥白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖，性溫，味苦、甘[1，2]，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效[3-9]，用于治療脾虛、腹瀉、水腫、胎動(dòng)不安等多種疾病。白術(shù)廣泛產(chǎn)于全國各地，市場以栽培品為主[10-13]。其近緣的混偽品主要有北蒼術(shù)、茅蒼術(shù)、菊三七、木香、土木香、關(guān)蒼術(shù)等[14]，因混偽品的摻雜，影響藥材的使用與臨床療效，所以有必要建立直觀、全面的白術(shù)質(zhì)量控制方法。性狀鑒別、顯微鑒別為兩種傳統(tǒng)的中藥材鑒別手段，具有易行、簡便和快速的特點(diǎn)，是常用的中藥材檢驗(yàn)方法。指紋圖譜作為中藥材質(zhì)量控制的有效手段之一，可將藥材信息綜合量化，直觀并多層次地反映藥材主要成分等，為藥材質(zhì)量控制提供更全面的信息[15]。

本研究首先對(duì)白術(shù)基源進(jìn)行鑒定，其次建立白術(shù)高效液相色譜指紋圖譜并對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，比較不同批次白術(shù)之間的差異，通過與混偽品對(duì)比實(shí)現(xiàn)白術(shù)的鑒別，為白術(shù)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供相關(guān)依據(jù)。

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

E100 顯微成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；LC-20A高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Agilent 1290 UHPLC-6530 Q/TOF MS，美國Agilent）；十萬分之一電子天平（中國梅特勒-托利多儀器有限公司）。

磷酸、乙醇、甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 材料

對(duì)照品：蒼術(shù)酮（atractylone）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（atractylenolide Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）購于成都曼思特生物科技有限公司（純度＞98%）。從市場上收集白術(shù)藥材20 批，經(jīng)本文作者陳君鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖；收集白術(shù)的近緣混偽品，經(jīng)陳君鑒定分別為：木香（Aucklandia lappa Decne.）、菊三七（Gynura japonica（Thunb.）Juel.）、北蒼術(shù)（Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.）、茅蒼術(shù)（Atractylodes lancea（Thunb.）DC.）、關(guān)蒼術(shù)（Atractylodes japonica Koidz.ex Kitam.）、土木香（Inula helenium L.）。

不同編號(hào)藥材的購買地：S1～S7 白術(shù)為浙江；S8～S14 白術(shù)為安徽；S15～S20 白術(shù)為河北。S21 關(guān)蒼術(shù)為黑龍江；S22 菊三七為湖北；S23 木香為四川；S24 土木香為河北；S25 茅蒼術(shù)為山西；S26 北蒼術(shù)為內(nèi)蒙古。

2 方 法

2.1 藥材鑒別

2.1.1 性狀鑒別 觀察藥材形態(tài)，斷面的顏色、質(zhì)地、油點(diǎn)以及氣味等特征。

2.1.2 顯微鑒別 藥材粉碎，過四號(hào)篩，取少量藥材粉末，水合氯醛溶液加熱透化，甘油酒精裝片，鏡檢，觀察粉末顯微特征。

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取一定量的蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品于50 mL 量瓶中，用甲醇溶解定容，搖勻，配制成各對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL 于同一10 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻，配制成蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ濃度分別為0.028、0.020、0.034、0.020 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定白術(shù)粗粉1.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，稱重，超聲30 min（250 W，30 kHz，35 ℃），取出，放冷，用甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，離心（13000 r·min-1）10 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05%磷酸（A 相）-乙腈（B 相），梯度洗脫（洗脫程序：0～7 min，5%～13%B；7～12 min，13%～23%B；12～25 min，23%～50%B；25～30 min，50%～62% B；30～45 min，62%～70% B；45～49 min，70%～90%B；49～60 min，90～100%B；60～65 min，100%B）；柱溫：25 ℃；檢測波長：232 nm；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按“2.2.3”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，考察各共有峰峰面積和保留時(shí)間的一致性。各共有峰保留時(shí)間RSD＜1%，峰面積RSD＜2%，說明儀器精密度良好。

2.3.2 重現(xiàn)性試驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.2.3”色譜條件分別進(jìn)樣測定，考察各共有峰峰面積和保留時(shí)間的一致性。各共有峰保留時(shí)間RSD＜1%，峰面積RSD＜2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液適量，按“2.2.3”色譜條件于第0、4、8、12、24、48 h 不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣測定，考察各共有峰峰面積和保留時(shí)間的一致性。各共有峰保留時(shí)間RSD＜2%，峰面積RSD＜2%，說明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 白術(shù)及其混偽品的性狀鑒別

白術(shù)呈不規(guī)則肥厚團(tuán)塊狀，表面具瘤狀突起，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)不易折斷，斷面不平坦，呈黃白色至淡棕色，有棕黃色的點(diǎn)狀油室散在，氣清香。茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)表面均無瘤狀突起；茅蒼術(shù)斷面有多數(shù)橙黃色或棕紅色油室，久儲(chǔ)會(huì)析出白毛狀結(jié)晶；北蒼術(shù)質(zhì)地疏松，香氣較淡；菊三七斷面存在凸起的筋脈紋，菊花心明顯；木香表面無瘤狀突起，氣特異；土木香表面無瘤狀突起，呈圓錐狀，斷面略平坦。經(jīng)上述觀察，白術(shù)與混偽品可被鑒別區(qū)分。見圖1。

圖1 白術(shù)及其混偽品藥材圖

3.2 白術(shù)及其混偽品的顯微鑒別

經(jīng)觀察比較，可以通過石細(xì)胞的大小與數(shù)量、纖維形態(tài)、油室多寡、菊糖紋理、有無草酸鈣針晶等特征來區(qū)分白術(shù)與幾種混偽品。白術(shù)粉末中草酸鈣針晶細(xì)小，存在于薄壁細(xì)胞；纖維稀少，呈長梭形，壁甚厚，孔溝及胞腔明顯；石細(xì)胞多，常單個(gè)散在；菊糖表面呈放射狀紋理；導(dǎo)管分子短小，為網(wǎng)紋導(dǎo)管及具緣紋孔導(dǎo)管；油室碎片較少。北蒼術(shù)粉末中石細(xì)胞甚多，常成群；纖維短棒狀，末端鈍圓；油室碎片多且易見；菊糖表面呈放射狀紋理。茅蒼術(shù)粉末中石細(xì)胞層紋明顯；纖維長梭形，壁甚厚；油室碎片多且易見；菊糖多見，表面呈放射狀紋理。關(guān)蒼術(shù)石細(xì)胞較小；纖維末端鈍圓或分叉；無菊糖。菊三七粉末中無石細(xì)胞及油室碎片；菊糖呈不規(guī)則塊狀，無放射狀紋理。木香粉末中無石細(xì)胞；菊糖眾多；表面呈放射狀紋理。土木香粉末中含草酸鈣方晶；無石細(xì)胞；菊糖呈不規(guī)則塊狀；表面無放射狀紋理。通過顯微鑒別白術(shù)與混偽品被明顯區(qū)分，見圖2。

圖2 白術(shù)及其混偽品粉末顯微圖

3.3 白術(shù)指紋圖譜的建立及相似性分析

使用國家藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723 版）軟件進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建及相似度評(píng)價(jià)，使用中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，共匹配出10 個(gè)共有指紋峰（見圖3）。通過與對(duì)照品比對(duì)共準(zhǔn)確鑒定出4 個(gè)共有峰，分別為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（2）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（5）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（6）、蒼術(shù)酮（9）。經(jīng)超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜分析，根據(jù)碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn)推測鑒定出其它6 個(gè)共有峰，分別為對(duì)羥基苯甲酸辛酯（1）、2-（聯(lián)苯基-4-基）乙醛（3）、3β-羥基蒼術(shù)酮（4）、芹烷二烯酮（7）、鄰苯二甲酸二丁酯（8）、4-（3-乙基-5-甲基-1-苯并呋喃-2-基）-2-丁酮（10）。9 號(hào)峰分離度最佳、峰面積較大，故選9 號(hào)峰作為參照峰（S峰），以參照峰為基準(zhǔn)計(jì)算白術(shù)各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜1%，符合中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求；各共有峰相對(duì)峰面積的RSD 在11%～37%，差異較大，說明各批次藥材中的成分含量存在波動(dòng)，其質(zhì)量存在差別。20 批藥材與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度在0.949～0.999（見表1）。

表1 藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

圖3 HPLC 色譜圖（A）混合對(duì)照品；（B）白術(shù)樣品

3.4 白術(shù)與其混偽品的指紋圖譜對(duì)比分析

取北蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)、菊三七、茅蒼術(shù)、木香、土木香藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，將所得圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》 軟件進(jìn)行相似度比對(duì)。各混偽品與白術(shù)的相似度范圍在0.018～0.513。如圖4 所示，白術(shù)指紋圖譜與混偽品的色譜圖輪廓差異較大。其中，茅蒼術(shù)、北蒼術(shù)與白術(shù)的相似度較小，分別為0.277、0.261，表明兩種蒼術(shù)與白術(shù)的化學(xué)成分存在明顯差異。關(guān)蒼術(shù)與白術(shù)的相似度最大，為0.513，表明兩者所含化學(xué)成分相對(duì)更接近。以上信息表明，古代典籍中統(tǒng)稱為“術(shù)”的蒼術(shù)和白術(shù)在固有成分上存在明顯差別，本研究所建立的色譜方法能對(duì)其進(jìn)行區(qū)分鑒別。而木香、土木香、菊三七與白術(shù)的相似度均在0.070 以下，與白術(shù)成分差異較大，所建立的指紋圖譜方法可成功將其鑒別區(qū)分。

圖4 白術(shù)與其混偽品HPLC 色譜圖

4 討論

本研究首先通過觀察藥材外觀形態(tài)、斷面質(zhì)地、油點(diǎn)等性狀特征，以及粉末中石細(xì)胞分布、油室多寡、菊糖紋理、纖維形態(tài)等顯微特征，利用傳統(tǒng)鑒別手段對(duì)白術(shù)及其混偽品進(jìn)行了鑒定區(qū)分。

通過對(duì)白術(shù)提取條件的考察，最終選擇以甲醇作為提取溶劑，料液比為1∶25，35 ℃超聲提取30 min制備供試品溶液，該制備方法所用時(shí)間短且提取率高。在DAD 檢測器條件下對(duì)白術(shù)樣品進(jìn)行了全波長掃描，發(fā)現(xiàn)在232 nm 處色譜圖出峰更多且響應(yīng)較好。對(duì)水-乙腈、0.05%磷酸-乙腈、水-甲醇、0.05%磷酸-甲醇等流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)0.05%磷酸-乙腈作為流動(dòng)相時(shí)各色譜峰分離度良好，最終確定了白術(shù)指紋圖譜的色譜條件。

通過對(duì)20 批白術(shù)藥材的分析，共匹配出10 個(gè)共有指紋峰構(gòu)成HPLC 指紋圖譜的特征峰。各混偽品與白術(shù)的相似度均較低，可與正品區(qū)分。所建指紋圖譜顯示，各批次白術(shù)藥材共有峰的相對(duì)峰面積差異較大，說明各批次藥材的質(zhì)量存在差別。

本研究運(yùn)用性狀、顯微鑒別傳統(tǒng)手段較快地甄別了白術(shù)正品與混偽品；所建立的指紋圖譜方法可直觀、多層次地表現(xiàn)出白術(shù)與混偽品之間的差異；兩者相輔相成為白術(shù)的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供了相關(guān)依據(jù)。之后還可進(jìn)一步與白術(shù)質(zhì)量標(biāo)志物的含量測定相結(jié)合，更準(zhǔn)確、全面地反映白術(shù)的整體質(zhì)量，為白術(shù)質(zhì)量控制提供更為可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。