LC-MS/MS 法測定人血漿中噻托溴銨的含量及其藥動學研究

劉 靨，林志昊，丁 黎*

1 中國藥科大學 藥學院藥物分析系，南京 210009；2 南京科利泰醫(yī)藥科技有限公司，南京210009

慢性阻塞性肺病（COPD）是一種慢性炎癥性氣道疾病[1，2]。噻托溴銨是具有特異選擇性的抗膽堿藥物，可以治療COPD。該藥物與人體呼吸道中的M1、M2、M3 毒蕈堿受體具有相似的親和力，一次性吸人對支氣管的擴張作用可持續(xù)24 h，可作為長效藥[3]。噻托溴銨作用于人體呼吸道，被制成粉劑通過吸入給藥，由于給藥劑量低至18 μg，故需要開發(fā)一種高靈敏度的分析方法以評價其人體藥動學特征。目前報道的幾種血漿中噻托溴銨LC-MS/MS 檢測法中，有取400 μL 血漿樣品經(jīng)蛋白沉淀后再檢測的方法，其定量下限可以達到0.5 pg·mL-1[4]；有取2 mL 血漿樣品經(jīng)固相萃取再檢測的方法，其定量下限可以達到1.5 pg·mL-1[5]；有取0.5 mL 血漿樣品經(jīng)2 步液-液萃取再采用二維UPLC-MS/MS 檢測的方法，其定量下限可以達到0.2 pg·mL-1[6]。以上幾種方法，操作繁瑣且樣品用量較大，不適合使用96 孔板進行高通量樣品處理，且靈敏度也有一定的局限性。噻托溴銨粉吸入劑人體生物等效性研究和單次給藥藥動學研究的給藥劑量均為18 μg，在該給藥劑量條件下，某些志愿者服藥后血漿中噻托溴銨的峰濃度不足2 pg·mL-1，根據(jù)《化學藥物制劑人體生物利用度和生物等效性研究技術(shù)指導原則》，其定量下限應能滿足測定3～5 個消除半衰期時、樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10～1/20 時的藥物濃度，0.2 pg·mL-1的定量下限不足以滿足測定要求，故有必要將檢測的定量下限設定在0.1 pg·mL-1。本實驗建立了采用96 孔板高通量處理噻托溴銨血漿樣品LCMS/MS 檢測血藥濃度新方法，該法定量下限可以達到0.1 pg·mL-1，并且可以應用于噻托溴銨粉吸入劑的人體生物等效性評價及低劑量單次給藥的人體藥代動力學研究。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

噻托溴銨對照品（加拿大ECO Research Chemicals 公司，純度：98.9%，批號：CT-11210-08）；噻托溴銨-d6（加拿大Toronto Research Chemicals 公司，純度：98.84%，批號：28-JHY-165-1）；噻托溴銨粉吸入劑（18 μg，Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &Co.KG，批號：001643）；甲醇、乙腈為色譜純；甲酸、醋酸銨為分析純；水為超純水。

1.2 儀器

ExionLC AD 高效液相色譜儀（日本島津公司）；Triple QuadTM6500+質(zhì)譜儀（Applied Biosystems/Sciex 公司）；十萬分之一電子天平（中國梅特勒托利多公司）。

1.3 液質(zhì)條件

色譜條件：ACE Excel 3 AQ 色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，ACE）；流動相A 為含0.1%甲酸和10.0 mmol·L-1醋酸銨水溶液，流動相B 為甲醇，線性梯度（A∶B）洗脫：0 min→0.4 min（75∶25）→0.5 min→3.0 min（65∶35）→3.1 min→4.6 min（0∶100）→4.7 min（75∶25）；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子化（ESI），正離子模式，多反應監(jiān)測（MRM），裂解電壓為5000 V，氣簾氣壓力為241 kPa，霧化氣壓力為207 kPa，輔助氣壓力為241 kPa，干燥氣溫度600 ℃,檢測反應離子對：噻托溴銨m/z392.1→152.1，噻托溴銨-d6 m/z 398.1→158.1。

1.4 溶液的配制

精密稱取噻托溴銨與噻托溴銨-d6 對照品適量，經(jīng)質(zhì)量校正后，以甲醇溶解分別得到噻托溴銨與噻托溴銨-d6 儲備液各1.00 mg·mL-1。將噻托溴銨的儲備液以50%的甲醇水溶液稀釋為一系列濃度分別為2、4、12、40、120、200、320 pg·mL-1的標準曲線工作液，以及濃度為2、5、20、100、240 pg·mL-1的質(zhì)控工作液；以50%甲醇水溶液稀釋噻托溴銨-d6 儲備液，配制成濃度為20.0 pg·mL-1的內(nèi)標工作液。

1.5 標準曲線和質(zhì)控樣品的配制

采用空白血漿配制標準曲線和質(zhì)控樣品。取380 μL 空白血漿，加入20 μL 的標準曲線工作液，配成濃度分別0.1、0.2、0.6、2、6、10、16 pg·mL-1的標準曲線樣品，以及濃度分別為0.1 pg·mL-1（LLOQ QC，定量下限質(zhì)控樣品）、0.25 pg·mL-1（LQC）、1 pg·mL-1（GMQC，幾何均值中濃度質(zhì)控樣品）、5 pg·mL-1（MQC，中濃度質(zhì)控樣品）、12 pg·mL-1（HQC，高濃度質(zhì)控樣品）的質(zhì)控樣品。

1.6 樣品前處理

在冰浴上，分別向兩塊96 孔板加入150 μL 樣品與25 μL 的內(nèi)標工作溶液，渦旋1 min，再分別加入525 μL 含1%甲酸的乙腈溶液，渦旋10 min，在室溫下4000 r·min-1離心10 min；將兩塊平行處理的96 孔板各取500 μL 上清液轉(zhuǎn)移至一塊干凈的96孔板中，于40 ℃下以氮氣流吹干，吹干的固體物以150 μL 超純水復溶，渦旋，離心3 min 后取20 μL 上清液進樣檢測。

1.7 藥代動力學研究

本實驗經(jīng)長沙市第三醫(yī)院倫理委員會批準，臨床受理號為CYHL2000007。14 名健康志愿者經(jīng)體檢證明心、肝、腎功能正常,肺活量FEV1 實測值/FEV1 預計值＞80%，均符合志愿者入選條件。試驗前志愿者均簽署知情同意書，試驗期間統(tǒng)一飲食。

14 名健康志愿者，在前一天晚上禁食10 h 之后，每位志愿者借助于給藥設備經(jīng)口吸入噻托溴銨粉吸入劑1 粒。于給藥前及給藥后于1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、30、45 min，1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96 h 采集靜脈血4.5 mL，將之加入到預冷的含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑的真空采血管中，在4 ℃下、1700×g 離心10 min，冰浴條件下分離血漿，于-70 ℃冰箱中保存待測。

2 結(jié)果

2.1 選擇性，線性以及定量下限

空白基質(zhì)中待測物或內(nèi)標保留時間其他因素無顯著干擾。見圖1。噻托溴銨標準曲線在線性范圍0.1～16 pg·mL-1線性良好，采用加權(quán)（Y=1/X2）最小二乘法，待測物質(zhì)量濃度C（pg·mL-1）為橫坐標X，以待測物峰面積與內(nèi)標峰面積比值（Ai）為縱坐標Y，進行線性回歸，求得回歸方程。通過計算，噻托溴銨的方程為：Y=1.274×102X+2.483×103，r2=0.998 3。科學計數(shù)法表示：Y=0.127 4X+2.483×10-3。

圖1 血漿樣品噻托溴銨與噻托溴銨-d6 的LC-MS/MS測定色譜圖

2.2 準確度和精密度

6 個重復的質(zhì)控樣品（LLOQ QC、LQC、GMQC、MQC 和HQC）按“1.6 樣品前處理”操作，根據(jù)隨行標準曲線求得實測濃度，在同一分析批中和連續(xù)3個分析批中評估批內(nèi)與批間的準確度（以相對誤差RE 計）與精密度（以相對標準偏差RSD 計）。見表1。

表1 人血漿中噻托溴銨測定的準確度與精密度

2.3 基質(zhì)效應和提取回收率

考察3 個濃度水平的樣品（0.25、5、12 pg·mL-1），以經(jīng)過提取所得的待測物色譜峰面積與未經(jīng)提取直接進樣所得的待測物色譜圖峰面積之比，來考察樣品的提取回收率，每個濃度水平樣品進行6 樣本分析。結(jié)果所有濃度水平的血漿中噻托溴銨的提取回收率在75.6%～84.8%，精密度RSD＜6.6%。說明該方法的提取回收率良好。

6 個不同來源含穩(wěn)定劑的空白人血漿，按“1.6”項下方法處理后，加入不同濃度噻托溴銨標準溶液及內(nèi)標，作LC-MS/MS 分析，獲得峰面積與相同濃度混合標準品溶液及內(nèi)標溶液直接進樣獲得峰面積、比較評價基質(zhì)效應，噻托溴銨基質(zhì)效應為100.1%～104.3%。表明該方法的基質(zhì)效應可以忽略不計。

2.4 穩(wěn)定性試驗

配制兩個濃度質(zhì)控樣品（LQC、HQC）并將其置于不同存放條件下，考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見表2。全血樣品在冰浴條件下2 h 穩(wěn)定；處理后的樣品在自動進樣器中5 天4 h 穩(wěn)定。

表2 噻托溴銨在不同存放條件下的血漿穩(wěn)定性的RE 值（n=3，%）

2.5 藥代動力學研究

按血漿樣品測定方法進行樣品處理與測定，按隨行標準曲線計算濃度。主要藥代動力學參數(shù)使用Phoenix WinNonlin software（version 6.4）依賴非房室模型計算，14 名志愿者血漿中噻托溴銨的平均藥時曲線圖見圖2，其藥代動力學參數(shù)見表3。

表3 噻托溴銨的主要藥代動力學參數(shù)

圖2 14 例健康志愿者空腹經(jīng)口吸入噻托溴銨粉吸入劑噻托溴銨的血藥濃度均值-時間曲線

3 討論

本實驗為達到0.1 pg·mL-1的定量下限，向兩塊96 孔板中分別加入150 μL 樣品與25 μL 的內(nèi)標，經(jīng)蛋白沉淀后，再將兩塊板的上清液合并至一塊96 孔板中吹干，達到富集待測物的作用，提高了靈敏度。

在實驗中發(fā)現(xiàn)，將兩個濃度的質(zhì)控樣品（LQC、HQC）放置室溫下18 h 后，待測物的含量與新鮮配制的質(zhì)控樣品相比，其含量降至45%（LQC）、48%（HQC），而噻托溴銨工作溶液在室溫下19 h 穩(wěn)定性良好，可排除工作溶液降解的可能。經(jīng)分析，噻托溴銨結(jié)構(gòu)中含有酯鍵，易被血漿中的酯酶水解。由于低溫可以降低酶促反應速率[7]，故考察將質(zhì)控樣品放置于冰浴條件下待測物的降解情況，結(jié)果表明，冰浴16 h 人血漿中噻托溴銨的相對含量為98.0%（LQC）、99.1%（HQC），故實驗在冰浴條件下操作。