血必凈注射液及其成分對肥大細胞脫顆粒作用的影響*

劉 玲，王 紅，朱星宇，郭志花，崔永偉**

1 南京市溧水區中醫院，南京 211200；2 揚州大學醫學院附屬醫院，南京 211200；3 江蘇護理職業學院，淮安223003

血必凈注射液是由紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸等5 味中藥經提取后，輔以葡萄糖和聚山梨酯80制備而成。主要功效是化瘀解毒，用于溫熱類疾病、因感染誘發的全身炎癥反應綜合征；還可配合治療多器官功能失常綜合征的臟器功能受損。然而其說明書和文獻中都提及血必凈注射液有皮膚潮紅、皮疹、瘙癢、呼吸困難、心悸、甚至過敏性休克等副反應，還有心血管系統[1]、呼吸系統[2]、消化系統[3]等方面的不良反應，且多發生在注射后30 分鐘內[4]。

有研究表明，中藥注射劑危及生命的嚴重不良反應主要是以肥大細胞脫顆粒釋放組胺為主的過敏及類過敏反應[5]，因此研究血必凈注射液中的功能性成分致敏的意義顯得尤為重要。現結合《中國藥典》及文獻中的有效成分和可能致敏成分，研究血必凈注射液及其含有的10 種化合物（結構見圖1）對P815 細胞脫顆粒、氨基己糖苷酶和組胺釋放的影響，為評價該注射液的致類過敏性提供參考。

圖1 血必凈注射液中10 種化合物結構式

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

生物倒置顯微鏡（日本Olympus IX51）；酶標儀（美國BioTek ELx800）；超凈工作臺（中國蘇州凈化SW-CJ-1FD）；臺式恒溫振蕩器（中國上海精宏實驗設備有限公司THZ-312）。

1.2 藥品與試劑

對照品：羥基紅花黃色素A（批號R17D10F106127），芍藥苷（批號L07M9Q60533），丹酚酸A（批號Z23D10X106625），丹酚酸B（批號P20J10F93457），咖啡酸（批號W16O10B100366），阿魏酸（批號L03A9D57744），洋川芎內酯Ⅰ（批號P16A10F85918），藁本內酯（批號R19D10F106243），綠原酸（批號Y22M8K36544），原兒茶醛（批號TO1013FB14），以上對照品純度均≥98%，均購自上海源葉生物科技有限公司；血必凈注射液購自天津紅日藥業（規格：10 mL/支，批號2002211）。

12 孔細胞培養板（美國Corning Incorporated 3599）；組胺ELISA檢測試劑盒（英國Abcam ab213975）。

CCK-8 細胞計數試劑盒（江蘇凱基生物技術公司，KGA317）；中性紅（中國 Aladdin N108712-25g）；氨基己糖（美國Sigma N9376）；生物活性化合物C48/80（美國Sigma 088M4120V）；Dulbecco's modifiedeagle medium（DEME）培養基（江蘇凱基生物技術公司KGM12800-500）；胎牛血清（FBS）（美國GIBCO 10100147）；實驗用水為超純水。

1.3 細胞株

P815 細胞購于江蘇凱基生物技術公司。

2 試驗方法

2.1 溶液配制

含藥培養基：各單體化合物用DMSO 配制成1 mol·L-1的母液，用時以培養基1∶1000 稀釋成工作液（1 mmol·L-1），血必凈注射液用時以培養基1∶10 稀釋成工作液（10%，設定其對應濃度為1 mmol·L-1），再依據各個試驗濃度用培養基稀釋成相應濃度。

氨基己糖溶液：稱取5 mg 氨基己糖溶解于1 mL的0.1mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中，配制成14mmol·L-1的氨基己糖儲備液。使用時，加入13 mL 的0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液稀釋成1 mmol·L-1氨基己糖工作液。混勻后使用0.22 μmol·L-1微孔過濾膜除菌，1.5 mL EP 管分裝，保存于-20 ℃低溫冰箱中。

0.1mol·L-1Na2CO3/NaHCO3溶液：分別稱取0.8401 g NaHCO3及1.0599 g Na2CO3溶于超純水中，混勻后定容至100 mL。

2.2 細胞培養

將P815 細胞培養于完全培養基（含有10%胎牛血清的DMEM 培養基）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。待細胞達到80%～90%匯合時，棄去培養基，加入適當的0.25%胰蛋白酶，使胰酶溶液均勻鋪在細胞表面，置于恒溫培養箱中消化，待細胞變圓后加入等體積的含血清的培養基終止消化，用移液器將細胞從培養瓶壁吹下，轉移至15 mL 離心管中，1000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，加入適量的完全培養基吹打混勻，按1∶2 的比例傳代。

2.3 10%抑制濃度（IC10）測定

細胞消化、計數、配制成濃度為5×104個/mL 的細胞懸液，在96 孔細胞培養板中，每孔加入100 μL細胞懸液，將該培養板置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。用完全培養基稀釋藥物至所需濃度，每孔加入100 μL 相應的含藥培養基，同時設立空白對照組，每組重復3 個（n=3），置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h。取出后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培養箱中繼續培養2 h，搖床輕輕混勻10 min，酶標儀于λ=450 nm 波長下，測定吸光度A 值，計算抑制率。

采用SPSS 軟件計算血必凈注射液及各化合物的IC10值。

2.4 對P815 細胞脫顆粒及生物活性介質釋放的測定

取對數生長期的P815 細胞，計數1×104個/mL接種于12 孔板中，接種體積為1 mL，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄去培養基。試驗組加入1 mL IC10濃度的各單體化合物及血必凈注射液，空白對照組加入1 mL 完全培養基，陽性對照組加入1 mL C48/80（60 μg·mL-1）刺激，每組重復3 個（n=3），于2 h 終止反應，收集反應液。

2.4.1 細胞脫顆粒百分率測定 以PBS 小心沖洗2次后，每孔加入500 μL 的1 中性紅染液，輕輕拍打培養板側面，于37 ℃染色3 min。隨機計數100 個細胞，記錄其中脫顆粒細胞的個數，計算其百分率。

2.4.2 組胺釋放量測定 以各成分的IC10為刺激濃度，通過ELISA 法測定組胺釋放量，取上清液，按Histamine ELISA 檢測試劑盒說明書進行操作，檢測上清液中組胺的釋放量。

2.4.3 氨基己糖苷酶釋放量測定 按“2.4”項下方法操作，收集上清液，加入0.1% Triton-100 細胞裂解液，將全部膜裂解，釋放細胞內的氨基己糖苷酶，得到細胞裂解液。取各組離心后的細胞上清液和裂解液100 μL 加入到96 孔酶標板中，同時再加入1 mmol·L-1氨基己糖溶液。置37℃細胞培養箱中反應45min。反應完畢加入150 μL 終止液（0.1 mol·L-1Na2CO3/NaHCO3）終止反應，15min 內用酶標儀測定λ=405nm處各孔反應液的吸光度A 值，結果減去陰性對照后，以上清液中氨基己糖苷酶釋放量與氨基己糖苷酶釋放總量之比，衡量試驗組刺激后氨基己糖苷酶的凈釋放量。

2.5 數據處理

以SPSS 20.0 計算各濃度組分的吸光度均數，并計算每一組分的IC10。組胺、氨基己糖苷酶釋放率及脫顆粒率結果均采用單因素方差分析，對比各試驗組與空白組統計學差異。P＜0.05 為顯著性差異。

3 結果

3.1 10%抑制濃度（IC10）測定

由表1 可知，在最大給藥濃度下（1000μmol·L-1），阿魏酸對P815 細胞的抑制率最高，達到30.92%，其他各成分均低于20.0%。表明血必凈注射液及其10種化合物并不會顯著抑制P815 細胞增殖。運用軟件計算各組的IC10值，由圖2 可知，化合物中阿魏酸的IC10值最小，為81 μmol·L-1；丹酚酸B 的IC10值最大，為847 μmol·L-1，兩者相差近10 倍。本品為含有多種組分以及各種輔料的混合溶液，其對P815 細胞的IC10值為331 μmol·L-1，與部分化合物相近。

表1 血必凈及其主要組分對P815 細胞的抑制作用（n=3）

3.2 細胞脫顆粒百分率測定

由圖3 可知，各組細胞的脫顆粒百分率與空白組相比，C48/80、綠原酸、蒿本內酯、咖啡酸、丹酚酸B 和血必凈注射液組細胞的脫顆粒百分率存在極顯著差異（P＜0.001）；原兒茶醛（P＜0.01）、羥基紅花黃色素A 和丹酚酸A（P＜0.05）組有顯著性差異；其余各組與空白組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 本品主要組分對P815 細胞脫顆粒百分率（%）的影響（n=3）

3.3 組胺釋放量測定

由圖4 可知，各試驗組上清液中組胺釋放量與空白組相比，除羥基紅花黃色素A 組以外，其余各成分組及血必凈注射液組均存在顯著性差異（P＜0.05），其中綠原酸、咖啡酸對組胺釋放的影響最大，組胺釋放量達6 ng·mL-1以上，高于陽性藥C48/80 組。

圖4 本品主要組分上清液中組胺釋放量（ng·mL-1）（n=3）

3.4 氨基己糖苷酶釋放量測定

由圖5 可知，空白組上清液中氨基己糖苷酶的釋放度最低，各試驗組與空白組相比，阿魏酸、芍藥苷組與丹酚酸A 組均無統計學差異，原兒茶醛、蒿本內酯、洋川芎內酯Ⅰ、羥基紅花黃色素A、丹酚酸B 組和血必凈注射液組的氨基己糖苷酶釋放量顯著高于空白組（P＜0.05），而陽性藥、綠原酸、咖啡酸組與空白組相比存在極顯著性差異（P＜0.001），3 組上清液中氨基己糖苷酶的釋放度均高于50%。

圖5 本品主要組分上清液中氨基己糖苷酶釋放度（%，n=3）

4 討論

4.1 化學成分選取

選取的10 個化合物是基于血必凈注射液的體內物質基礎，結合《中國藥典》[6]中規定的相關中藥材的含量測定標準及文獻報道有顯著藥理活性或有潛在致敏性的化學成分。羥基紅花黃色素A、芍藥苷、阿魏酸和丹酚酸B 是各中藥材在藥典中規定的含量測定成分，原兒茶醛、迷迭香酸、綠原酸、咖啡酸、丹酚酸A 和藁本內酯既是血必凈注射液的成分[7]，也是藥理作用顯著的有效成分。藁本內酯、咖啡酸、原兒茶醛和洋川芎內酯Ⅰ[8-10]具有抗炎功效，原兒茶醛還可以促進血管舒張[11]；綠原酸能抗氧化、抗菌、調節免疫[12]；丹酚酸A 可抗心肌缺血損傷[13]。

其中咖啡酸是綠原酸的主要代謝產物，而綠原酸一方面有很好的藥理活性，另一方面臨床使用中含綠原酸的中藥注射劑不良反應較多，且過敏反應最為常見[14]。丹酚酸A 和丹酚酸B 可能與黃疸等相關不良反應有關[15]。藁本內酯可能通過孕烷X 受體途徑引發藥物代謝酶的誘導效應，導致代謝性藥物相互作用的發生[16]。因此，選取10 種化合物考察其對P815 細胞脫顆粒、氨基己糖苷酶和組胺釋放的影響，為評價血必凈注射液的致類過敏性提供參考。

4.2 試驗模型以及給藥濃度的選取

近年來，常用于研究體外過敏的細胞模型有P815、RBL-2H3 和Ku812 細胞。有文獻研究表明，同RBL-2H3 相比，在相同刺激條件下，P815 細胞活化后脫顆粒時間出現更早、程度更高[17]；相對于RBL-2H3 和Ku812 細胞，P815 細胞更適合作為一種早期、穩定、敏感的肥大細胞脫顆粒體外檢測模型[18]。故本試驗選取P815 細胞作為體外過敏模型。

由于10 種化學成分理化性質不同，對P815 細胞生長的影響也不盡相同，因此采用CCK-8 法測定各化合物不同濃度下對P815 細胞的抑制率，通過軟件算出各化合物相應的10%抑制濃度作為給藥濃度。各化合物在該濃度條件下，在一定時間內，對P815 細胞的生長影響一致，最大程度保證在試驗過程中各組細胞狀態一致，對后續脫顆粒、組胺和氨基己糖苷酶的測定影響最小。

4.3 對P815 細胞的影響

由試驗結果看出，與空白組相比，血必凈注射液中含有的綠原酸和咖啡酸能極顯著地引起P815細胞脫顆粒、釋放組胺及氨基己糖苷酶；原兒茶醛、蒿本內酯和丹酚酸B 對P815 細胞的脫顆粒及組胺釋放有較大影響，也能一定程度上影響氨基己糖苷酶的釋放，與所引文獻中可能導致藥物不良反應或相互作用的化合物基本一致。此外，血必凈注射液本身也會顯著引起P815 細胞脫顆粒和釋放組胺，并一定程度上增加氨基己糖苷酶的釋放。

綜上，本次試驗結果可一定程度上為評價血必凈注射液的致類過敏性提供初步參考；但本試驗僅采用了體外P815 細胞模型，且樣品也是未經人體吸收代謝的原型成分，其過敏機制以及引起過敏反應的物質基礎還需要結合生物體內分布代謝的過程，并運用體內外模型進行深入研究。