二氫楊梅素對異丙腎上腺素誘導小鼠心肌纖維化的影響及機制研究

張月月，許曉樂

1 南通大學附屬第三醫院 藥學部，南通 226001;2 南通大學藥學院 藥理系，南通226001

心肌纖維化是與心臟損傷和疾病相關的常見病理變化。盡管在某些情況下，膠原和其他細胞外基質蛋白的沉積可能具有一定的保護作用；但延長的纖維化通常會對心臟功能產生負面影響，并導致有害的后果。抑制心臟纖維化可以改善心血管疾病、尤其是心衰患者的預后。二氫楊梅素（DMY）是藤茶中含量最豐富的天然黃酮類化合物，具有多種有效的生物和藥理活性。在心血管方面，DMY 能抑制動脈粥樣硬化斑塊形成[1]，改善糖尿病小鼠心肌和血管內皮功能[2，3]，減輕阿霉素誘導的心臟毒性[4]，改善心肌缺血/再灌注損傷[5]，減輕主動脈縮窄引起的心肌肥厚[6]等。DMY 對心肌纖維化作用及機制研究尚未見報道。本研究首次采用皮下注射異丙腎上腺素建立小鼠心肌纖維化模型，觀察DMY 對心肌纖維的防治作用及初步探討其作用機制，為DMY 在心血管疾病方面的開發和臨床應用提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性C57BL/6 小鼠，22-25 克，購買于南通大學實驗動物中心，許可證號是：SYXK（蘇）2017-0046。

1.1.2 藥品及試劑 DMY 購自西安天豐生物科技有限公司，含量為98%，批號NF-20 151110；美托洛爾（Met）購于Selleck 公司；異丙腎上腺素（ISO）購于Sigma-Aldrich 公司；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、羥脯氨酸（HYP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于南京建成生物公司；腫瘤壞死因子α（TNFα）、白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒、組織總蛋白和核蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒均購于江蘇海門碧云天生物技術研究所；總RNA 提取試劑盒購于北京天根生物技術公司；組蛋白H2A（Histone H2A）抗體（#2578）和核因子紅細胞素相關因子2（Nrf2）抗體（#12721）均購自美國Cell signaling 公司；轉化生長因子-β1（TGF-β1）抗體（21898-1-AP）、膠原蛋白Ⅰ（Collagen Ⅰ）抗體（67288-1-Ig）、膠原蛋白Ⅲ（Collagen Ⅲ）抗體（22734-1-AP）、平滑肌肌動蛋白α（α-SMA）抗體（55135-1-AP）均購自中國ProteinTech 公司；核轉錄因子κB（NF-κB p65）抗體（ab7970），抗體p-Smad2（ab53100）、p-Smad3（ab52903）、Smad2（ab40855）Smad3（ab40854）均購自美國Abcam 公司；抗體GAPDH（kc5G4）購自中國Kangchen 公司；其它試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 全套BIO-RAD 電泳及轉膜系統（美國Bio-Rad L 公司）；Synergy H1 全功能微孔板檢測儀（美國Bio-TEK 公司）；實時定量PCR 系統（Thermo Fisher 公司）；Odyssey 雙色紅外激光成像系統（LI-COR 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 小鼠背部皮下注射ISO，第1天劑量為5 mg·kg-1·d-1，之后以2.5 mg·kg-1·d-1劑量維持30 天，自由進食、給水；正常對照組小鼠皮下注射相同體積的生理鹽水。小鼠隨機分為5 組，即正常對照組、模型組、DMY 高（DMYH，200 mg·kg-1·d-1）、低劑量組(DMYL，100 mg·kg-1·d-1）、陽性對照藥美托洛爾組（50 mg·kg-1·d-1）；每組10 只。各組小鼠均每日灌胃給藥1 次，連續給藥30 天。藥物混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中。正常對照組和模型組給予相同體積的溶媒。

建模結束，取鼠眼眶血與鼠心臟。

1.2.2 實驗取材 造模結束前，實驗動物禁食12 h，給以充足的水。取材前，小鼠稱重。眼眶取血，將鼠心臟放入冷生理鹽水中洗滌，心臟用濾紙吸干后稱重，計算心重指數（CWI）。取部分左心室組織置入4%的多聚甲醛中固定待切片染色，其余部分液氮速凍。

CWI（mg·g-1）=全心重/體重

1.2.3 血清中LDH 和CK 含量檢測 血清中LDH活性測定采用丙酮酸法，CK 活性測定采用肌酸顯色法,按照試劑盒說明書配制試劑及操作，分別在波長440 nm 和660 nm 處測定血清LDH 和CK 活性。

1.2.4 血清中TNF-α、IL-6 含量檢測 按照試劑盒說明書用ELISA 法檢測血清中TNF-α、IL-6 含量。

1.2.5 Masson 染色 小鼠心臟樣本在10%甲醛溶液中固定、石蠟包埋、切片心肌組織進行Masson 染色，具體方法參照本研究以往的報道[7]。用Image J軟件對圖像進行分析，計算心肌膠原容積分數（CVF）。CVF 為膠原陽性藍色的面積占組織總面積的比值。

1.2.6 心肌組織HYP、MDA、SOD 及GSH-Px 測定 取適量心肌組織，準確稱重。按照重量體積比1∶9 加入9 倍體積生理鹽水，剪碎組織，冰浴中制備10%組織勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取上清液。心肌組織HYP、MDA、SOD、GSH-Px 測定分別按照相關檢測試劑盒的說明書操作。

1.2.7 Western blot 檢測 組織總蛋白和核蛋白提取，以及BCA 蛋白定量按各自試劑盒說明書進行。將蛋白樣品配平后加上樣緩沖液，95 ℃、5 min 滅活，備用。按需配制凝膠，加樣后，80 V 電泳至Marker 分離后換100 V 電泳。轉膜后，將膜放入封閉液中，4 ℃過夜。漂洗后，一抗4 ℃孵育過夜；二抗室溫避光孵育2 h。漂洗后，以紅外激光成像掃描儀掃膜顯影，并用圖像分析系統進行灰度分析。

1.2.8 實時定量熒光PCR 檢測 小鼠左心室勻漿后，參照RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA，并進行逆轉錄，置于實時定量PCR 儀中進行PCR 檢測，具體方法參照本研究以往的報道[7]。以18 s 作為內參基因，實驗結果以2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

引物序列如下：TNF -α：5’ -CGTCAGCCGATTTGCTATCT-3’（Forward）和5’-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG -3’（Reverse）；IL -6：5’ -AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’（Forward）和5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA -3’（Reverse）；18s：5’ -CGCGGTTCTATTTTGTTGGT-3’（Forward）和5’-AGTCGGCATCGTTTATGGTC-3’（Reverse）。

1.3 數據統計分析

2 結果

2.1 DMY 對小鼠血清LDH 和CK 的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清LDH 和CK 含量均顯著增加（見圖1A 和圖1B）；與模型組相比，給予DMY 高、低劑量及美托洛爾均能顯著降低小鼠血清LDH 和CK 含量，表明DMY 能減輕異丙腎上腺素引起的心肌損傷。

圖1 DMY 對小鼠血清LDH 和CK 的影響

2.2 DMY 對小鼠體重和心重指數的影響

實驗結束時，各組小鼠體重未出現顯著性差異（見圖2A）。與正常對照組相比，模型組小鼠心臟變大，心重指數（CWI）顯著增加。與模型組相比，給予DMY 高劑量和美托洛爾能顯著降低CWI（見圖2B）。

圖2 DMY 對小鼠心重指數的影響

2.3 DMY 對小鼠心肌纖維化的影響

Masson 結果顯示，正常對照組心肌間質纖維組織較少，與正常對照組相比，模型組心肌間質可見較多纖維組織（見圖3A）。膠原容積分數CVF 計算結果顯示，模型組較正常對照組顯著增加（見圖3B）。與模型組相比，給予DMY 高、低劑量及美托洛爾能減輕心肌間質纖維組織，顯著減少CVF（見圖3A 和圖3B）。與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織中羥脯氨酸含量顯著增加，而給予DMY 高、低劑量和美托洛爾能顯著降低小鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量（見圖3C）。與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和α-SMA 蛋白表達顯著增高；與模型組相比，給予DMY 高、低劑量和美托洛爾均顯著降低小鼠心肌組織中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ和α-SMA 蛋白表達（見圖3D-F）。

圖3 DMY 對小鼠心肌纖維化的影響

2.4 DMY 對小鼠心肌組織中TGF-β1/Smad 信號通路相關蛋白表達的影響

與正常對照組相比，模型組TGF-β1 蛋白表達顯著增高，同時TGF-β1 下游信號通路中Smad2 和Smad3 的磷酸化表達顯著增高；與模型組相比，給予DMY 高、低劑量和美托洛爾均顯著降低小鼠心肌組織中TGF-β1 蛋白表達以及Smad2 和Smad3 的磷酸化表達（見圖4）。

圖4 DMY 對小鼠心肌組織中TGF-β1/Smad 信號通路相關蛋白表達的影響

2.5 DMY 對小鼠心肌組織中氧化應激的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織中MDA 含量顯著增高，抗氧化物酶SOD 和GSH-Px活性顯著降低。與模型組相比，給予DMY 高、低劑量和美托洛爾均顯著減少MDA 含量，增強抗氧化物酶SOD 和GSH-Px 活性。Nrf2 是抗氧化信號通路關鍵因子，結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝臟Nrf2 入核顯著減少，而給予DMY 高、低劑量和美托洛爾均顯著增加Nrf2 的入核（見圖5）。

圖5 DMY 對小鼠心肌組織中氧化應激的影響

2.6 DMY 對小鼠心肌組織中炎癥反應的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清中TNFα、IL-6 含量顯著增加，同時心肌組織中TNF-α、IL-6 mRNA 表達顯著提高；與模型組相比，給予DMY高、低劑量和美托洛爾均顯著減少血清中TNF-α、IL-6 含量和心肌組織中TNF-α、IL-6 mRNA 表達。與正常對照組相比，模型組小鼠心肌組織中炎癥轉錄因子p65-NF-κB 入核顯著增加；與模型組相比，給予DMY 高、低劑量和美托洛爾均顯著減少p65-NF-κB 入核（見圖6）。

圖6 DMY 對小鼠心肌組織中炎癥反應的影響

3 討論

心臟纖維化是幾乎所有類型心臟病終末期的特征。心肌細胞外基質的積累導致心律失常和心功能受損的風險增加，最終發展為心力衰竭。因此，尋找和開發減輕心肌纖維化的藥物對防治心肌纖維化、降低死亡率具有重要意義[8]。

心臟病的臨床前模型是揭示心臟纖維化發展過程中涉及的復雜發病機制的重要工具，進而可以確定新的治療靶點和促進抗纖維化藥物的發現。許多臨床前模型已被用于研究心臟纖維化，一般來說，臨床前模型可以根據誘導方式大致分為手術誘導、化學誘導和遺傳模型三大類。每種模型都有其自身的優勢和局限性。ISO 皮下注射誘導的心肌纖維化模型優勢在于方法簡單且無創接近自然病理進程。ISO 作用于β1-腎上腺素受體以增加心臟收縮力和速率，激活腎素血管緊張素醛固酮系統，促進了心臟肥大和心肌纖維化的發生發展[9]，該模型已用于篩選大量植物藥產品及其活性成分[10]。根據文獻報道[11]，本研究采用給小鼠皮下注射ISO 30 d的方法建立小鼠心肌纖維化模型。ISO 模型組小鼠血清LDH 和CK 含量均顯著增加，說明ISO 導致了心肌損傷；模型組小鼠心臟變大，CWI 顯著增加，說明長期注射ISO 導致心肌肥大；模型組小鼠心肌間質纖維組織顯著增多，反映結締組織疾病的膠原代謝情況的羥脯氨酸含量顯著增加，提示成功復制了ISO 致心肌纖維化模型，該方法簡便、經濟、可靠。在小鼠心肌纖維化模型制備成功的基礎上，觀察了DMY 對ISO 誘導的心肌纖維化的作用。結果顯示，DMY 能降低血清LDH 和CK 含量，減輕心肌損傷；降低小鼠CWI 和心肌中羥脯氨酸含量；病理染色結果顯示，DMY 可以減輕小鼠心肌纖維化程度，降低心肌組織中膠原沉積，具有防治心肌纖維化的作用。

實驗研究已證實ISO 能通過多種途徑增加TGF-β1 這一關鍵的致心肌纖維化細胞因子的表達和其在心肌中的含量[9，10]。TGF-β1 能通過自分泌和旁分泌方式刺激心肌成纖維細胞增殖，并使心肌成纖維細胞向α-SMA 高表達的肌成纖維細胞轉化，從而使Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ等膠原蛋白在心肌中大量生成并沉積，許多促纖維化因子均通過它們起到作用。此外，TGF-β1 還通過信號轉導途徑影響其他細胞因子，形成細胞因子網絡，使其致纖維化效應增強。因此，TGF-β1 過度表達在纖維化機制中起到關鍵作用，TGF-β1 也多作為治療纖維化病變的靶標[12]。本實驗結果顯示，DMY 能抑制ISO 導致的小鼠心肌中TGF-β1 蛋白表達及α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ蛋白表達。研究表明，Smad2/3蛋白復合物是纖維化過程中TGF-β1 的經典的下游靶標。過度的TGF-β1/Smad2/3 信號或心臟成纖維細胞中TGF-β1 刺激的長期效應，被認為是心臟纖維化的生理、病理基礎[12]。以往實驗已證明，抑制Smad2/3 可抑制心臟成纖維細胞中的纖維化基因程序和細胞外基質重塑[12]。考慮到這一點，Smad 蛋白亦是減少纖維化的重要靶點。實驗結果顯示，DMY能降低注射ISO 導致的小鼠心肌組織中Smad2 和Smad3 的磷酸化表達。以上結果表明，對TGF-β1/Smad2/3 信號通路的抑制機制參與了DMY 減弱心肌纖維化的作用。

氧化應激參與心肌梗死后左心室重構和心力衰竭的發生和發展。這些發現表明，氧化損傷和纖維化相互作用，并在惡化的心臟重塑過程中加速結構改變和心室功能障礙。抗氧化劑被證明能改善心臟功能并產生抗纖維化作用[13]。大量實驗已證明，ISO 通過誘導心臟組織中的氧化應激而引起毒理學變化，從而導致抗氧化物酶的消耗，促進心肌纖維化的發生[9，10，13]。

本實驗結果表明，與正常對照組相比，ISO 誘導的小鼠心肌組織中脂質過氧化損傷的生物標記物MDA 含量增強，而抗氧化物酶SOD 和GSH-Px 活性顯著降低。而給與DMY 能降低心肌MDA 含量，增強抗氧化物酶SOD 和GSH-Px 活性。Nrf2 通路是抗氧化系統的中心，在心臟病，尤其是心臟纖維化的治療中具有越來越重要的意義。Nrf2 是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，調節抗氧化蛋白的表達，防止損傷和炎癥引起的氧化損傷[14]。Nrf2 是一個復雜調節網絡的核心，在代謝、炎癥、自噬、蛋白質保留、線粒體生理學和免疫反應的調節中發揮著許多重要作用[14]。當遇到應激條件時，如氧化應激，Nrf2 被人體的防御機制激活并進入細胞核，增加抗氧化相關基因、血紅素加氧酶-1、SOD、GSH-Px 和硫氧還蛋白等的轉錄。DMY 對Nrf2 的作用已在不少病理模型上被證實。比如Tian X 等[15]報道DMY 可通過調節Nrf2 信號通路減輕膿毒癥急性腎損傷。Qiu P 等[16]報道DMY 通過促進Nrf2 核易位對乙醇誘導的肝損傷具有保護作用。本實驗結果表明，給予ISO 作用的小鼠DMY 能顯著增加Nrf2 的入核。這些結果提示，DMY 能增強Nrf2 的核轉錄，由此推測增加了抗氧化酶SOD 和GSH-Px 的活性，發揮抗氧化作用清除ROS，有助于減輕心肌纖維化。

眾所周知，炎癥反應在心臟纖維化中起著重要作用。炎癥和氧化應激也存在互相影響。炎癥細胞因子、趨化因子和生長因子通過直接作用于成纖維細胞、刺激成纖維巨噬細胞和淋巴細胞的募集和激活，以及觸發血管細胞和心肌細胞中的成纖維程序，參與了心臟纖維化的發病機制。此外，長期慢性炎癥可能導致心肌細胞壞死，引發修復性纖維化。促炎細胞因子TNF-α、IL-6 的水平在許多與纖維化相關的心肌病理條件下顯著升高。TNF-α、IL-6 致纖維化作用可能涉及對成纖維細胞的直接或間接的作用，與巨噬細胞的募集、基質細胞蛋白的誘導和具有顯著成纖維細胞激活特性的生長因子、如TGF-β1 的上調有關[17]。

本實驗結果顯示，DMY 能減少ISO 作用的小鼠血清中TNF-α、IL-6 含量和心肌組織中TNF-α 和IL-6 mRNA 表達。轉錄因子NF-κB 控制各種炎癥細胞因子的誘導。在正常情況下，NF-κB p65 亞單位與其抑制對應物Iκ-Bα和其他IκB 蛋白結合，形成存在于細胞質中的非活性復合物。當激活后，Iκ-Bα 被磷酸化，導致p65-NF-κB 的激活和移位進入細胞核，在那里它介導炎癥基因如TNF-α、IL-6 的表達[18]。Zhao Y 等[19]報道DMY 可通過抑制NF-κB介導的炎癥和TGF-β1 調節的PI3K/Akt 信號通路逆轉硫代乙酰胺誘導的肝纖維化。Zhou MQ 等[20]報道二氫楊梅素通過NF-κB 途徑保護脂多糖誘導的心肌細胞損傷。本實驗結果表明，在心肌纖維化模型上DMY 可顯著減少p65-NF-κB 入核，減輕炎癥反應，亦有助于減輕心肌纖維化。

綜上所述，本研究證明，DMY 能減輕ISO 誘導的小鼠纖維化。DMY 可通過增強Nrf2 抗氧化信號通路減輕心肌氧化應激，抑制轉錄因子p65-NF-κB活化，減輕心肌炎癥反應，有助于干預TGF-β1/Smad2/3 信號通路的活化，減輕心肌纖維化。這些結果表明，DMY 可能是預防和治療心肌纖維化的有前途的候選藥物。