基于iTRAQ多重標記串聯質譜技術系統性篩選乳腺癌患者血清蛋白表達的差異分析

劉艷翠　　張欣　　李文媛　　孫成　　孫平　　趙微

[摘要] 目的 觀察串聯質譜技術在乳腺癌血清蛋白表達中的差異。方法? 選取2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫學院附屬二院收治的乳腺癌新輔助化療患者20例作為研究組，包含10例化療有效患者及10例化療無效患者，同時選取8名健康者作為對照組。采集所有患者的肘靜脈血，分別采用高通量miRNA、iTRAQ表達譜測序技術，從“組學”的角度對乳腺癌新輔助化療不同療效患者miRNA差異表達譜、外周血單個核細胞蛋白組進行研究。隨后，先進行Pathway通路分析，該過程在蛋白質層面進行，然后找出sRNA的成熟體序列，在此過程中嚴格根據miRbase18數據庫。將已知的cDNA序列整理為一行，對得到的sRNA對應靶基因進行預測，Pathway分析靶基因，最后將同一Pathway通路中的sRNA靶基因及蛋白質尋找出來。結果? 研究組和對照組共篩選出19個差異表達蛋白，選取其中具有較大表達差異的肝細胞生長因子（HGF）進行驗證。iTRAQ標記圖譜顯示，研究組和對照組的血清HGF表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標記圖譜鑒定結果。結論? 串聯質譜技術用于篩選發現乳腺癌細胞HGF表達水平升高具有顯著效果，可有效指導臨床診治乳腺癌的工作，將有效參考提供給靶向治療藥物的開發。

[關鍵詞] iTRAQ多重標記串聯質譜技術;系統性篩選;乳腺癌;血清蛋白表達

[中圖分類號] R737.9? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）16-0033-03

Analysis on serum protein expression differences in breast cancer patients systematically screened by iTRAQ-based tandem mass spectrometry

LIU Yancui1 ZHANG Xin2? LI Wenyuan1 SUN Cheng1 SUN Ping1 ZHAO Wei1

1.Teaching and Research Room of Anatomy， Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China; 2.Department of Ultrasound， the Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University of Heilongjiang Province， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective? To analyze the effectiveness of isobaric tags for relative and absolute quantitation （iTRAQ）-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients. Methods A total of 20 patients with neoadjuvant chemotherapy for breast cancer were selected as the study group， which contained 10 patients with effective chemotherapy and 10 patients with ineffective chemotherapy， and 8 healthy subjects were selected as the control group at the same time. Elbow venous blood was collected from all patients， and high-throughput sequencing in micro-ribonucleic acid （miRNA） expression profiling and iTRAQ technique were used to study the differential miRNA expression profiles and peripheral blood mononuclear cell proteome of patients with different efficacy of neoadjuvant chemotherapy for breast cancer from the perspective of “omics”. Subsequently， the Pathway analysis was performed at the protein level， and then the mature sequences of small RNA （sRNA） were identified， in which the miRbase18 database was strictly followed. The known complementary deoxyribonucleic acid （cDNA） sequences were organized into one line， the target genes corresponding to the obtained sRNA were predicted and analyzed by the Pathway analysis， and finally the sRNA target genes and proteins in the same Pathway were screened out， and the correlation between differential proteins and miRNA target genes was analyzed. Results A total of 19 differentially expressed proteins in the study and control groups were screened out， and hepatocyte growth factor （HGF） with great expression differences was selected for validation. iTRAQ labeling-based profiles showed that there was a statistically significant difference between study group and the control group in serum HGF expression levels （P<0.05）. The Western Blot validated and proved that serum HGF expression levels in patients of stage Ⅰ， stage Ⅱ and stage Ⅲ in the study group were progressively increased （P<0.05）， and were higher than those in the control group （all P<0.05）， which was consistent with the results of iTRAQ labeling-based profile identification. Conclusion iTRAQ-based tandem mass spectrometry for systematic screening of serum protein expression differences in breast cancer patients reveals elevated HGF expression levels in breast cancer cells， which will effectively guide the clinical diagnosis and treatment of breast cancer and provide an effective reference to the development of targeted therapeutic drugs.

[Key words] iTRAQ-based tandem mass spectrometry; Systematic screening; Breast cancer; Serum protein expression

盡管乳腺癌新輔助化療的蛋白質組學研究已在組織和血清水平發現一系列差異表達蛋白，且miRNA表達譜測序技術的應用使得乳腺癌相關miRNA取得一定的成績，但這些研究僅涉及乳腺癌表達蛋白檢測和miRNA差異表達譜，即差異表達蛋白和miRNA差異表達的研究是割裂的[1]。目前，尚未見到二者之間相關聯的研究。這也為后續的研究提供了契機。本研究統計分析2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫學院附屬二院乳腺癌新輔助化療患者20例的臨床資料，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2020年2月～2021年2月黑龍江省牡丹江醫學院附屬二院乳腺癌新輔助化療患者20例作為研究組，包含10例化療有效患者及10例化療無效患者，同時選取8名健康者作為對照組。研究組患者年齡29～57歲，平均（38.26±6.45）歲;TNM分期：Ⅰ期7例（35.00%），Ⅱ期10例（50.00%），Ⅲ期3例（15.00%）。對照組8名健康者均為女性，年齡30～58歲，平均（39.14±6.86）歲。兩組研究對象的一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基于iTRAQ技術研究乳腺癌患者外周血單個核細胞蛋白表達譜? 督促患者空腹至少8 h，采集肘靜脈血6 ml，放置在10 ml EDTA-2K抗凝管中。分離外周血單個核細胞，此過程嚴格依據Feicoll分離液說明書。提取蛋白質并定量，采用SDS電泳、蛋白質酵解、iTRAQ標記、SCX分離、基于Triple TOF 5600分析LC-ESI-MS/MS、Western blot對實驗進行驗證。最后，采用Mascot蛋白質鑒定軟件，運用IPI_human v3.87數據庫（91464 sequences）檢索和鑒定蛋白[2]。

1.2.2 高通量測序技術研究乳腺癌新輔助化療患者外周血單個核細胞miRNA表達譜? 分離外周血單個核細胞，此過程嚴格依據Feicoll分離液說明書。提取總RNA，對RNA濃度進行檢測，利用Solexa技術測序進行Small RNA文庫構建和測序，分析兩組樣本miRNA差異。驗證Stem-loop qRT-PCR對部分差異表達miRNA，分析Small RNA數據處理和信息。

1.2.3 乳腺癌新輔助化療患者外周血單個核細胞蛋白質組與miRNA關聯分析? 將候選miRNA和蛋白選取出來，分別運用The miRanda、TargetScan和PicTar三大miRNA靶基因預測數據庫找到差異表達miRNA共有的靶基因，預測miRNA靶基因，最后進行生物信息學分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 iTRAQ標記圖譜鑒定結果

iTRAQ標記圖譜顯示，兩組研究對象的血清HGF表達水平差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 Western Blot 驗證差異蛋白

研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標記圖譜鑒定結果。見表1。

3 討論

新輔助化療（NAC）在早期乳腺癌的治療中能夠促進腫瘤的縮小、手術切除機會的提升，同時能夠對體內療效進行直接評估，因此通常在對化療敏感性的影響因素進行探究的過程中應用[3～5]。如果患者經新輔助化療將病理學結果完全緩解，其預后更好[6，7]。在蛋白質組學中，定量蛋白質組學占有重要地位[8，9]?；趇TRAQ技術的蛋白質組學研究是近年來發展起來的新技術，可在宏觀的角度上系統地從復雜的蛋白質組中探測數千種蛋白質，高通量、高靈敏度、高準確性研究疾病發展機制和治療機制[10]。iTRAQ技術包括肽反應、報告、平衡3個部分[11]。其中，肽反應部分能夠對上肽段進行標記，原因為共價連接肽N端與氨基酸側鏈，該部分能對幾乎所有的蛋白質進行標記[12];報告部分可有8種，因此iTRAQ試劑能夠對8組樣品進行標記[13]。iTRAQ在標記完蛋白質后通過平衡部分保證其標記的肽段質核比相同，最終得知樣本蛋白質的定量信息[14]。

既往研究結果表明，乳腺癌與特定蛋白質和miRNA具有密切關系，但同時也表明這些研究均以某一蛋白質或某一miRNA作為出發點進行研究，尚未將蛋白質和miRNA作為宏觀整體進行分析[15，16]。新輔助化療治療乳腺癌具有極為復雜的影響機制[17，18]。因此，miRNA與蛋白質的研究應綜合起來，才能系統地對乳腺癌新輔助化療療效機制有一個整體的認識，同時也有助于治療靶點的篩選[19，20]。本研究結果表明，研究組和對照組共篩選出差異表達蛋白19個，選取其中具有較大的表達差異的肝細胞生長因子（HGF）進行驗證。iTRAQ標記圖譜顯示，兩組血清HGF表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。研究組Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期患者的血清HGF表達水平逐漸升高（P<0.05），均高于對照組（均P<0.05），符合iTRAQ標記圖譜鑒定結果，說明iTRAQ技術能夠幫助臨床充分了解疾病的病理機制，從而有效防控和診治疾病。

綜上所述，串聯質譜技術對發現乳腺癌細胞HGF表達水平升高具有較高的臨床價值，可對臨床診治乳腺癌工作起到有效指導，且給靶向治療藥物的開發提供有效參考。

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（收稿日期：2021-07-06）