伊藤雜種‘巴茨拉’不同外植體無菌體系建立及愈傷組織誘導

孫茂桐，李際紅，任 靜，秦永健，盧 潔，孟凡志*

(1.山東農業大學，山東 泰安 271018； 2.山東省林業保護和發展服務中心，山東 濟南 250014)

‘巴茨拉’(Paeonia (Itoh Group) ‘Bartzella’)屬于芍藥組(Paeonia Sect.Paeonia)與牡丹組(Paeonia Sect.Moutan) 植物雜交所培育出的一類組間遠緣雜交種， 又稱伊藤雜種 (Paeonia Itoh)[1]。 ‘巴茨拉’ 兼具芍藥(Paeonia lactiflora Pall.)的生長特性和牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的花形特征，有明顯的雜種優勢，具有花大而艷麗，株型飽滿，抗逆性強的特點[2]。 另外，‘巴茨拉’具有罕見的黃色花色，是公認最美的伊藤雜種，具有極高的觀賞價值和經濟價值[3]。

由于‘巴茨拉’主要依靠嫁接和分株的方式進行繁殖，導致其繁殖系數較低和培育周期較長[4]，而組織培養作為一種高效的無性繁殖方式是實現‘巴茨拉’產業化生產的理想手段。 目前對‘巴茨拉’再生體系的研究主要集中在叢生芽誘導方面[5]，而對愈傷組織誘導方面研究較少。 愈傷組織具有較高的再生能力，可被誘導直接分化或先誘導體胚再分化成苗，是進行再生體系研究的良好材料[6]。 因此探索高效穩定的愈傷組織誘導方法對推動‘巴茨拉’組培快繁及離體再生研究具有一定的理論和實踐意義。

近年來，國內外學者對‘巴茨拉’同屬的芍藥和牡丹愈傷組織誘導進行了大量研究。 劉蓉等[7]以‘鳳丹’幼胚作為外植體誘導出愈傷組織，并證明H2O2對愈傷組織誘導具有促進作用。蒲艷[8]以‘滇牡丹’葉柄作為外植體篩選出2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA 的激素組合對誘導愈傷組織效果最佳。 劉廣甫[9]以芍藥品種‘粉玉奴’莖段為材料進行愈傷組織誘導研究時發現不同的光質對愈傷組織誘導具有顯著影響，紅光對愈傷組織誘導最有利。

然而目前伊藤雜種在這方面的研究較少，且由于其芽生于地下的生長習性[10]和酚類物質含量高的生理特點[7]在無菌體系建立階段具有諸多困難。 因此本研究以鱗芽、莖段、葉柄、嫩葉作為外植體探究‘巴茨拉’的無菌體系建立及愈傷組織誘導方法。 為后續‘巴茨拉’的組培快繁提供一定的理論和實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2020年12月從山東農業大學林學實驗站大田挖出‘巴茨拉’帶有鱗芽的根莖，一部分鱗芽被立即切下作為外植體；另一部分被埋藏在基質中，于實驗室內暗培養，待抽生黃化嫩枝后取嫩葉、葉柄、莖段3 部分與鱗芽一起作為實驗中的四類外植體(圖1)。

圖1 莖段、嫩葉、葉柄、鱗芽外植體（圖中比例尺為2 cm）Figure 1 Stem segment, young leaves, petiole and scale bud explants

1.2 實驗方法

1.2.1 升汞不同處理時間對外植體的滅菌效果

使用洗滌劑清洗四種外植體表面， 后在流水下沖洗1 h， 置于超凈工作臺中使用酒精處理20 s， 再在0.1%的升汞中浸泡滅菌，為了對比不同升汞(0.1%)處理時間的滅菌效果，設置3 min、5 min、8 min、12 min 4 個處理時間，最后使用無菌水沖洗3～4 次后接種到不含激素的培養基中，培養14 d 后統計不同外植體的污染率及存活率。

1.2.2 褐化抑制劑對不同外植體褐化率及存活率的影響

為探究褐化抑制劑種類及濃度對莖段、葉柄、葉片3 種外植體褐化率的影響，選擇AC(活性炭)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、Vc(抗壞血酸)3 種褐化抑制劑并分別設置3 種不同濃度，AC(0 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L)、Vc(0 mg/L、5、10 mg/L)、PVP(0 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L)，使用L9(33)正交表安排共9 種處理，每個處理重復3 次，每次重復接種嫩葉、葉柄、莖段各20～25 個，培養30 d 后統計褐化率及存活率。

1.2.3 激素對不同外植體愈傷組織誘導的影響

為探究激素種類及濃度對莖段、葉柄、嫩葉3 種外植體愈傷組織誘導率及誘導出的愈傷組織質量的影響，將3 種外植體分別接種到添加2,4-D 或6-BA 的培養基中，兩種激素各設置3 個濃度2,4-D(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)、6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L)，共計6 種處理，每個處理重復接種3 次，每個重復接種20～25 個外植體。 培養4 周后統計愈傷組織誘導率并調查愈傷組織質量。

1.2.4 不同形態外植體愈傷組織誘導的表現

為探究將外植體處理成不同形狀后對愈傷組織出現時間和愈傷組織量的影響，選擇莖段外植體，將其分別橫切成4～5 mm 厚的薄片、縱剖成1 cm 長的小段，2 種形狀的莖段外植體接種到添加1.0 mg/L 6-BA 的愈傷組織誘導培養基中，每種形狀接種20～25 個，重復3 次。 分別在5 d、20 d、45 d 時調查愈傷組織誘導情況并拍照。

1.3 統計及分析方法

使用單因素方差分析(p＜0.01)，以Duncan 法進行差異顯著性分析，所有分析均使用SPSS 進行。

褐化率%=褐化的外植體數/接種的外植體數×100

存活率%=存活的外植體數/接種的外植體數×100

誘導率%=誘導出愈傷組織的外植體數/接種的外植體數×100

1.4 培養條件

實驗中使用的基本培養基均為1/2MS 培養基， 添加瓊脂7 g/L、 蔗糖30 g/L， 調節pH 為5.8，121℃/0.1Mpa 滅菌20 min。 培養室溫度為25±1℃，光照時間為16 h/d，光照強度2000 1x。

2 結果與分析

2.1 0.1%升汞不同處理時間對外植體的污染率的影響

由圖2 可知滅菌時間對不同外植體污染率及褐化率的影響不同。其中鱗芽滅菌效果最差，升汞處理12 min鱗芽外植體仍有46.67%的污染率， 存活率僅有28.86%，故認為鱗芽不適合進行愈傷組織誘導。與鱗芽相比莖段和葉柄滅菌效果較好， 升汞處理3 min后只有26.66%和20.0%的污染率，繼續提高處理時間能夠繼續降低污染率但其存活率也會明顯下降，因此莖段和葉柄適宜處理時間為3 min。 為保證嫩葉有足夠高的成活率，升汞處理時間最長可選擇8 min，此時污染率能夠降低到18.86%，因此嫩葉適宜的升汞處理時間為8 min。

圖2 4 種外植體不同滅菌時間下的污染率及存活率Figure 2 Contamination rate and survival rate of four explants under different sterilization time

從滅菌難度的角度來說鱗芽不適宜用來進行愈傷組織誘導，而莖段、葉柄、嫩葉滅菌效果較為理想可用來進行愈傷組織誘導，且最適0.1%升汞處理時間分別為3 min、3 min、8 min。

2.2 褐化抑制劑對不同外植體褐化率及存活率的影響

在添加有褐化抑制劑的培養基中3 種外植體的褐化程度均低于對照，且不同褐化抑制劑對外植體褐化的抑制效果不同(見圖3)。 其中添加AC(活性炭)對莖段和嫩葉褐化的抑制作用與未添加相比均不明顯，只有在葉柄外植體中，添加1.0 g/L 的AC可使其褐化率降低16.31%；而添加500 mg/L 的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)能夠使3 種外植體的褐化率大幅降低，但濃度提高到1000 mg/L 并不能繼續降低褐化率；與PVP 相比Vc(維生素c)對3 種外植體褐化的抑制效果有明顯的劑量效應，隨著其添加濃度的提高褐化率具有進一步降低的趨勢。

圖3 3 種外植體在各處理中的褐化率Figure 3 Average Browning rate of three kinds of explants in each treatment

由此可知， 添加500 mg/L 的PVP 及15 mg/L Vc 能夠顯著降低3種外植體的褐化率， 而1.0g/L 的AC可有效抑制葉柄褐化。

2.3 激素對不同外植體愈傷組織誘導的影響

接種30 d 后，3 種外植體在不同培養基中均能誘導出愈傷組織， 但3種外植體在不同培養基中的愈傷組織誘導率不同。 由表1 可知3 種外植體均在Y2 培養基中具有最高的愈傷組織誘導率且顯著高于其他水平，在此培養基中莖段、葉柄、葉片的愈傷組織誘導率分別為81.72%、84.95%、68.82%。 由圖4 可知在最佳培養基Y2 中3 種外植體愈傷組織生長速度和愈傷組織量不同，5 d 時3 種外植體均未產生愈傷組織，15 d 時莖段和嫩葉已產生少量愈傷組織而葉柄尚未產生愈傷組織，30 d 時3 種外植體均已產生愈傷組織，其中莖段和葉柄產生的愈傷組織量明顯大于嫩葉，因此認為莖段和葉柄更適合用來進行愈傷組織誘導。

表1 不同激素濃度下三種外植體的愈傷組織誘導率Table 1 Callus induction rate of three explants under different hormone concentrations

2.4 不同形態外植體愈傷組織誘導的表現

由圖5 可知，接種5 d 時薄片狀外植體形成層已有愈傷組織形成，而段狀外植體尚未形成愈傷組織。 接種20 d 時薄片狀外植體的愈傷組織已沿形成層產生一圈愈傷組織突起，而段狀外植體剛剛開始形成愈傷組織。接種45 d 時薄片狀外植體和段狀外植體均已形成大量愈傷組織，其中薄片狀外植體已被完全被愈傷組織包裹，而段狀外植體僅一端產生愈傷組織團。

圖5 不同形狀莖段外植體接種5d、20d、45d 時的愈傷組織誘導情況(圖中比例尺為0.5 cm)Figure 5 Callus induction of stem segment explants with different shapes after inoculation for 5d, 20d and 45d

3 結論與討論

3.1 褐化抑制劑對不同外植體褐化率及存活率的影響

褐化會嚴重影響植物材料的脫分化及再分化能力，褐化發生的最主要原因為傷口中多酚類物質與多酚氧化酶接觸，在酶促的作用下多酚類物質轉化為醌類物質影響植物生長[11]。因此影響褐化的一個主要因素就是外植體的傷口大小[12]，而在3 種外植體中莖段和葉柄的傷口最大因此更易褐化。

本實驗選擇了3 種褐化抑制劑：Vc(維生素C)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、AC(活性炭)，并安排了9 個處理的實驗對他們的褐化抑制作用進行比較。 其中PVP 對莖段、葉柄、嫩葉的褐化率具有明顯抑制作用，這樣與國外在芍藥中的實驗結果一致[13]。 而不同濃度AC 僅僅只對葉柄影響較大，對莖段、嫩葉影響不大，這可能是由于AC 抑制褐化是通過物理吸附作用，作用另2 種化學試劑導致[14]。 Vc 通過抑制醌類物質氧化發揮作用，其對莖段、葉柄、嫩葉的褐化率均有較大影響。

3.2 激素對不同外植體愈傷組織誘導的影響

本研究通過單因素實驗篩選出對3 種外植體最佳的愈傷組織誘導培養基為1/2MS+1.0mg/L 6-BA，在此培養基中3 種外植體的愈傷組織誘導率分別為81.72%、84.95%、68.82%。 不同的外植體在愈傷組織誘導過程中的表現不同，莖段和葉片愈傷組織出現的時間較葉柄更早，這可能是由于嫩葉和莖段處于較早的發育階段，響應激素變化的速度更快[15]。 莖段和葉柄相比葉片愈傷組織產生的面積更大，莖段和葉柄整個橫斷面均可產生愈傷組織，而嫩葉僅有葉脈的傷口處產生愈傷組織。

3.3 不同形態外植體愈傷組織誘導的差異

已有證據表明在植物的組織培養過程中外植體的形狀對其再生效果具有重要影響[16]。 本研究通過比較段狀和薄片狀2 種形狀的外植體在愈傷組織誘導過程中的表現，得出薄片狀比段狀更適合進行愈傷組織誘導。推測將外植體切割成不同形狀會影響其與培養基的接觸方式，以及外植體的傷口大小。外植體與培養基接觸面積越大會更有利于其吸收水分和營養物質，還會使其更好地接受激素刺激。