順鉑誘導急性腎損傷關鍵基因的篩選和調控網絡的構建

楊玲云 徐錦雯 劉洵薇 成蕓 周紅霞 趙麗萍

無錫市兒童醫院腎臟風濕免疫科，無錫 214000

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指在多種因素誘導下短期內出現腎功能減退的綜合征，部分還可轉變為慢性腎損傷甚至進展為終末期腎病，影響患者生命質量，并給家庭帶來沉重的負擔［1-2］。急性腎損傷病因多樣，如缺血再灌注損傷、敗血癥、藥物腎毒性等，而順鉑是導致化療患者急性腎損傷最常見的原因。順鉑是最有效的化療藥之一，可用于膀胱癌、頭頸部腫瘤、小細胞肺癌等惡性腫瘤的治療。但順鉑在腎臟的蓄積導致腎小管的炎癥、壞死，引起急性腎損傷限制其應用［3］。順鉑誘導急性腎損傷（cisplatin-induced AKI，CI-AKI）的機制尚不十分明確，暫無有效藥物防治。

本研究挖掘了CI-AKI 過程的關鍵基因和信號通路，以期為腎臟保護提供新思路。我們在基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）中下載了CI-AKI 小鼠模型的測序數據，使用生物信息學分析篩選CI-AKI 組和正常組中的差異基因。采用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組大百科全書數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進行相關通路的富集分析，蛋白質互作網絡（protein–protein interaction，PPI）及cytoscape 軟件鑒定關鍵基因，并構建了轉錄因子（transcription factor，TF）/微小RNA（microRNA，miRNA）/信使RNA（mRNA）調控網絡。

資料與方法

1、資料來源

數據提取時間：建庫至2021年3月1日。我們從GEO（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）分別下載GSE106993 和GSE153625 數據。兩組數據平臺均為GPL21103，Illumina HiSeq 4000（小家鼠）。GSE106993 含有CI-AKI 組小鼠4 只，對照組小鼠4 只。GSE153625 含有CI-AKI 組小鼠4 只，對照組小鼠8 只。兩組小鼠均為19～21 周C57BL/6 小鼠，測序組織為腎臟。

2、差異基因的篩選

采用Sangerbox（soft.sangerbox.com）軟件對數據進行分析，其中R軟件分析部分選用的是limma包（v 3.32.7）［4］。納入標準是logFC≥1、FDR≤0.05。

3、GO及KEGG富集分析

通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網站對差異基因進行GO及KEGG分析。

4、關鍵基因的篩選及鑒定

通過STRING數據庫（https：//string-db.org/）構建差異基因的互作網絡圖，并使用Cytoscape 軟件以互動得分0.4 為閾值對互作網絡進行分析。然后使用cytohubba 插件鑒定關鍵基因。選取點度中心、接近中心、中介中心3 種算法排名前十的基因區交集。

5、構建TF/miRNA/mRNA 調控網絡

通過TransmiRv2.0數據庫（http：//www.cuilab.cn/transmir）對轉錄因子調控的miRNAs 進行預測，并與差異miRNAs 取交集，得到候選miRNAs［5］。通過miRWalk2.0在線軟件（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）對候選miRNAs 進行靶基因（mRNA）的預測（miRWalk、miRanda、RNA22 和Targetscan 4 個軟件預測得到共同靶基因），并與差異mRNAs 取交集（mNRA 與miRNA表達呈負相關）［6］。

6、靶向關鍵基因的中草藥的預測

通過ETMC 數據庫（http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/）篩選靶向關鍵基因的中草藥，并取交集（同時靶向≥4個關鍵基因）［7］。

結果

1、CI-AKI小鼠模型中差異基因的分析

比較CI-AKI 組和對照組小鼠模型中基因的表達，在GSE106993 中得到1 387 個上調基因和1 182 個下調基因（圖1A）。在GSE153625 中得到1 751 個上調基因和1 442 個下調基因（圖1B）。通過取交集，得到CI-AKI 組中上調基因817個，下調基因769個（圖1C、D）。

圖1 順鉑誘導急性腎損傷組與對照組的差異基因。A：GSE106993 中差異基因的火山圖；B：GSE153625 中差異基因的火山圖；C：GSE106993和GSE153625中共同上調的基因；D：GSE106993和GSE153625中共同下調的基因

2、CI-AKI小鼠模型中差異基因富集分析

圖2、圖3 GO 及KEGG 富集分析結果顯示，上調基因的生物過程主要涉及炎癥和凋亡，下調基因的生物過程包括氧化還原和代謝，其中氧化還原是最重要的生物學過程，并包含最多的差異基因（圖2A）；細胞外泌體、細胞質、黏著斑等細胞組成被上調基因所富集，而線粒體、線粒體內膜及基質被下調基因所富集，其中細胞外泌體是最主要的細胞組成（圖2B）；上調基因的分子功能主要是蛋白的結合，包括蛋白酶、鈣黏蛋白、層黏蛋白的結合，而氧化還原酶的活化、催化酶的活化以及同向轉運體的活化被下調基因所富集，并且氧化還原酶的活化富集到最多的差異基因，提示氧化還原酶的活化是最重要的分子功能（圖2C）；KEGG 分析結果顯示代謝信號通路是最重要的通路，主要被下調基因所富集，而上調基因富集得到腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、P53信號通路。

圖2 差異基因的基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書數據庫（KEGG）通路分析。A：差異基因生物過程富集分析；B：差異基因細胞組成富集分析；C：差異基因分子功能富集分析；D：差異基因KEGG通路分析

圖3 上調基因和下調基因的基因本體論（GO）和京都基因與基因組大百科全書數據庫（KEGG）分析。A：上調基因；B：下調基因

3、CI-AKI過程中關鍵分子的鑒定

為了進一步挖掘差異基因中的關鍵分子，使用STRING網站構建差異基因的蛋白互作網絡圖，并運用Cytoscape 中cytohubba插件進行分析。選取點度中心、接近中心、中介中心3 種算法排名前十的基因取交集，得到8 個共同基因，其中上調基因：腫瘤蛋白P53（tumor protein P53，Trp53）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、信號傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，Stat3）、Jun、胱 冬酶3（caspase 3 apoptosis related cysteine protease，Casp3）、鈣黏蛋白1（cadherin 1，Cdh1）、前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），下調基因：過氧化氫酶（catalase，CAT），具體見表1。并構建了8個關鍵基因的相互作用網絡（圖4A）。

表1 8個關鍵基因3種中心度算法的值

4、TF/miRNA/mRNA 網絡的構建

通過對GSE106993 中基因的重新注釋，發現CI-AKI 組中差異表達的27 個miRNAs（圖4B）。同時，使用TransmiR v2.0 鑒定8 個關鍵基因中的轉錄因子，得到2 個轉錄因子（Stat3、Jun）及其可能調控的miRNAs，并與差異miRNAs 取交集。最后，通過miRWalk2.0 對候選miRNAs 的靶基因進行預測并與差異mRNAs 取交集，得到4 個miRNAs 及其靶基因214個（圖4C）。

5、靶向關鍵基因的中草藥篩選

搜索ETMC 數據庫，發現5 個關鍵基因（Trp53、Casp3、Ptgs2、EGF、Jun）可成為中草藥治療的靶點。通過對5 個關鍵基因的候選中草藥取交集，最終得到2 種可能用于治療CI-AKI的中草藥（桑葉、半夏）（圖4D）。

圖4 基因互作網絡。A：8個關鍵基因的蛋白互作網絡；B：轉錄因子（TF）/微小RNA（miRNA）/信使RNA（mRNA）調控網絡；C：差異表達miRNA；D：中藥與靶基因的調控網絡

討論

順鉑具有穿透力強、療效好、作用譜廣、能與多種藥物協同作用等優點，作為一線藥物可用于多種癌癥的治療，但其腎毒性以及CI-AKI 嚴重限制了順鉑在臨床中的應用。明確其發生發展機制，找尋有效的藥物防治該病尤為重要［8］。

本研究基于GSE106993 和GSE153625 兩個數據集，得到共同差異基因1 586 個，其中上調基因817 個、下調基因769 個。GO 富集分析顯示上調基因主要與炎癥和凋亡相關，而氧化還原過程及相關分子功能被下調基因所富集。KEGG 富集分析顯示，腫瘤壞死因子通路、P53 信號通路相關基因在CI-AKI 過程中上調，而代謝通路相關基因則下調。

炎癥反應是一個復雜的生物學過程，貫穿急性腎損傷的各個階段［9］。壞死細胞釋放胞內信號物質誘導促炎因子和趨化因子的釋放，招募各種炎性細胞浸潤，導致更多細胞死亡，形成細胞死亡-炎癥的惡性循環［10］。TNF-α激活核因子-κB 的轉錄，促進炎癥相關基因的轉錄表達［11］。TNF-α不僅能誘導炎癥反應，還能激活死亡受體通路，促進細胞凋亡［12］。有研究表明，P53 信號通路參與了TNF-α 誘導的凋亡過程［13］。P53 可通過改變線粒體膜的通透性激活線粒體凋亡途徑，誘導細胞凋亡［14］。在下調基因中富集到多個線粒體相關生物學過程、細胞成分及分子功能，這些提示CI-AKI 過程中存在線粒體功能障礙。線粒體功能障礙導致氧自由基生成增加，加重線粒體功能障礙，同時伴有大量細胞因子的釋放，誘導炎癥反應［15］。因此，炎癥反應、細胞凋亡、線粒體功能障礙三者交互作用導致CI-AKI 的發生與發展。

通過構建PPI 網絡，我們得到8 個關鍵基因（上調：Trp53、EGF、Stat3、Jun、Casp3、Cdh1、Ptgs2，下調：CAT）。小鼠基因與人類基因有個高度的同源性。已有研究表明，我們篩選到關鍵基因的人類同源基因在人體CI-AKI 過程中發揮重要作用。研究發現P53 在CI-AKI 早期表達上調，抑制P53 能改善CI-AKI［16］。P53 以 多種形成參與到CI-AKI過程，一方面調控細胞的多種死亡方式如：凋亡、壞死、鐵死亡等，另一方面影響細胞的自噬過程［14，17-18］。STAT3是重要的炎癥調控基因，它可以調節炎癥介質的釋放參與炎癥反應，同時還能通過線粒體途徑誘導細胞的凋亡［19-20］。抑制STAT3 的表達能顯著改善順鉑誘導的急性損傷后的細胞凋亡和炎癥反應［21］。c-Jun 是核轉錄激活蛋白1 重要組成部分，能夠調節死亡以及炎癥相關基因的表達［22］。c-Jun在多種腎臟疾病被激活，抑制c-Jun 的活化能改善腎臟炎癥反應［23］。Casp3是細胞凋亡的最終執行者，受到多條凋亡通路的調控如TNF 通路，P53 通路［12，14］。CDH1 是鈣黏蛋白家族的一員，其編碼的E-鈣黏蛋白更是上皮間質轉化的重要標志。研究表明E-鈣黏蛋白在急性腎損傷的小管細胞細胞中低表達，上調E-鈣黏蛋白能緩解CI-AKI過程中的炎癥反應和細胞凋亡［24］。EGF 是一種具有多種功能的細胞因子，在缺血再灌注損傷的小管細胞中低表達，而外源性的EGF有助于腎功能的恢復［25-26］。PTGS2 是炎癥過程中的重要介質，通過調控前列腺E2 合成，促進白介素6 的表達，介導多種炎癥反應［27］。選擇性PTGS2抑制劑能減輕腎小球和腎小管的損傷，緩解急性腎損傷的進展［28］。CAT 是抗氧化系統中的重要一員，它能將過氧化氫分解成水和二氧化碳。CAT在CI-AKI模型中低表達，上調CAT能保護腎功能［29］。

miRNA 是一類在轉錄后調節基因表達的非編碼RNA（19-25 核苷酸長度），它參與急性腎損傷的多個生物學過程。研究發現miR-449 在CI-AKI 中高表達，異常表達miR-449 通過去乙酰化酶1/P53/Bcl2 關聯X 蛋白通路調節腎小管上皮細胞凋亡［30］。而人工合成的miR-500a-3p脂質體載體能顯著改善腎損傷［31］。miRNA的表達受多種方式調節，其中轉錄因子是最常見的一種。P53 誘導的miR-199a-3p 降低雷帕霉素的表達和磷酸化，促進腎小管上皮細胞的腎損傷和細胞凋亡［32］。我們通過分析得到了多個差異表達的miRNA，并構建了TF/miRNA/mRNA 的調控網絡，揭示CI-AKI過程中的潛在調控網絡。

中藥治療急性腎損傷已有一些研究，知柏地黃丸能通過抑制Casp3的活化，減輕慶大霉素誘導的小管上皮細胞的凋亡［33］。白藜蘆醇是一種天然酚化合物，它可通過活化去乙酰化酶1，去乙酰化P53，減輕順鉑誘導的小管上皮細胞的凋亡。我們通過靶向關鍵基因，篩選到了兩味中藥：桑葉和半夏。桑葉提取物桑葉黃酮能緩解高尿酸誘導的急性腎損傷［34］。桑葉提取物桑葉生物堿能減少氧自由基的產生，減輕氧化應激誘導的急性腎損傷［35］。半夏白術天麻湯通過上調銅鋅超氧化物歧化酶和CAT2的表達，調控高血壓性腎損傷中的氧化應激反應［36］。

本研究旨在為CI-AKI 的研究提供新思路，通過分析CI-AKI 小鼠模型中的差異基因，我們得到8 個關鍵基因和3 條重要通路，并構建了TF/miRNA/mRNA 調控網絡，揭示關鍵轉錄因子潛在的調控機制。最后通過靶向關鍵基因，篩選到了兩味中藥，為CI-AKI的治療提供參考藥物。