憂遁草中黃酮苷的分離純化以及對上皮性卵巢癌抗腫瘤作用的研究

隋紅梅 賀鳳喜 李愛華 李愛峰 王麗 路煥喜

1聊城市婦幼保健院婦科，聊城 252000；2聊城市人民醫院婦產科，聊城 252000；3聊城大學化學化工學院，聊城 252000；4聊城市東昌府區人民醫院婦科，聊城 252000通信作者：李愛華，Email：18663529788@126.com；李愛峰，Email：lxpsdta2001@sina.com

晚期上皮性卵巢癌具有高復發率、高病死率的特點［1］，鉑耐藥是所有患者的共同歸宿，也是主要致死原因［2-3］，尋找新型抗腫瘤藥物成為亟待解決的問題。憂遁草是一種傳統中藥材，廣泛分布于我國南部至西南部地區［4］，黃酮苷是其主要成分，對多種癌癥有抑制作用，如：乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、肺癌等［5］，但在上皮性卵巢癌中的研究中鮮有報道。本研究（研究時間：2019 年10 月至2022 年3 月）旨在分離純化憂遁草中的黃酮苷成分，探討其對于上皮性卵巢癌的作用及潛在機制，為卵巢癌的化學藥物治療及憂遁草藥用價值的開發提供理論依據。

材料與方法

1、實驗材料

上皮性卵巢癌細胞A2780、SKOV3、OVCAR3 均由聊城市人民醫院中心實驗室提供；DMEM 高糖培養基、CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒、總RNA提取試劑（Trizol）、M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（B532435）、2xSG Fast qPCR Master Mix（Low Rox）（B639272）、GAPDH

引物（正向：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'；反向：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'）、Bcl-2 引物（正向 ：5'-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3' ；反 向 ：5'-GAACTCAAAGAAGGCCACAATC-3'）、Beclin-1 引物（正向：5'-ACATCTGGCACAGTGGACAGTTTG-3' ；反 向：5'-AGCATGGAGCAGCAACACAGTC-3'）、RIPA 裂解液、5X蛋白加樣緩沖液、Anti-BECN1 antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG、Anti-BCL2（Pho-spho-Thr69）antibody、HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG、蛋白預染Maker、苯甲基磺酰氟、30%Acr-Bis（29：1）溶液、1M Tris-HCL，pH=8.8、10%SDS 溶 液、1M Tris-HCL，pH=6.8、10X Tris-Glycine SDS-PAGE 電泳緩沖液、10X 印跡膜轉印緩沖液、PVDF 印跡膜、10X TBST WB 漂洗液、Annexin V 凋亡檢測試劑盒（均購至生工生物工程股份有限公司）。

2、實驗方法

2.1、憂遁草中黃酮苷的提取、分離純化和鑒定 將憂遁草粉碎，用20 倍量75%乙醇超聲提取3 次，每次30 min，過濾，提取液經減壓濃縮得粗提物。用HPD-100 型大孔吸附樹脂對粗提物中的黃酮苷進行富集，上樣后首先用水洗脫10 個柱體積以除去強極性雜質，再用40%乙醇-水溶液洗脫7 個柱體積將黃酮苷洗脫下來。用半制備型高效液相色譜儀對富集后的黃酮苷進行分離純化，色譜柱為C18（250.0 mm×25.4 mm，10 μm），流動相為甲醇-水（34：66，V/V），流速為25 ml/min，檢測波長為330 nm，柱溫為室溫。根據色譜圖手動收集目標組分餾分，減壓濃縮除去溶劑，其純度用高效液相色譜法進行檢測，化學結構經核磁共振波譜分析進行鑒定。

2.2、細胞培養 使用含10%滅活胎牛血清和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM 培養基培養傳代細胞，于5%CO2、37 ℃恒溫細胞培養箱中培養。細胞傳代時使用0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細胞，DMEM 培養基終止消化并離心，DMEM重懸后接種于培養皿中。

2.3、細胞增殖實驗 應用CCK-8 法檢測細胞增殖。取對數生長期的卵巢癌細胞消化離心，以每孔5×104個細胞均勻接種于96 孔板中，并放置在培養箱中培養過夜。將憂遁草黃酮苷提取物用甲醛溶解，按照10 μg/μl、20 μg/μl、40 μg/μl、60 μg/μl、80 μg/μl、100 μg/μl 的濃度梯度作用于細胞，每個濃度有3個副孔，分別處理24 h、48 h。然后向每孔中加入CCK-8溶液（每孔100 μl 加 入10 μl CCK-8 溶液）。以加入等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對照組。在37 ℃孵育2 h 后，用酶標儀測定450 nm 處的吸光值（OD）。

2.4、細胞凋亡檢測 選取對數生長期的細胞，將上皮性卵巢癌細胞用DMEM 完全培養基制成單細胞懸浮液，用血球計數板計數，調整細胞密度為1×105個/ml，接種5 ml 于T25培養瓶中，放置在環境溫度為37 ℃、CO2濃度為5%的孵化箱中24 h，使細胞貼壁。將提取物以不同的濃度作用于細胞，置入5%CO2孵箱37 ℃培養24 h，進行細胞計數，使每管中含有1×106個細胞。根據Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit（E607127）試劑盒說明書進行操作，用流式細胞分析儀檢測細胞凋亡率。

2.5、熒光定量PCR 檢測 根據RNA 提取試劑盒說明書，將經憂遁草黃酮苷提取物處理后的細胞進行RNA 提取，根據M-MuLV 第一鏈cDNA 合成試劑盒（B532435）說明書操作進行反轉錄合成cDNA，實時熒光定量PCR 檢測Bcl-2 與Beclin-1 的mRNA 相對表達量，mRNA 的相對表達量按照公式2–ΔΔCt計算。

2.6、Western-blot 檢測 提取經憂遁草黃酮苷提取物處理后細胞中的總蛋白，BCA 法檢測蛋白的濃度，加入適量蛋白上樣緩沖液，調整為相同蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳后將蛋白條帶轉印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h 后，分別加入Bcl-2、Beclin-1 的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次后加入二抗，室溫孵育1 h 后，再用TBST 洗膜3 次。在PVDF膜上加入適量的顯影液，在蛋白顯影儀顯影。實驗重復3次。

3、統計學分析

使用統計軟件SPSS 22.0、GraphPad Prism 對實驗結果進行統計學分析。應用單因素方差分析進行細胞半抑制濃度（IC50）值的測定，應用GraphPad Prism 進行作圖分析，符合正態分布的計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

1、憂遁草中黃酮苷的結構鑒定

經核磁共振波譜3 種黃酮苷分析為：肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荊苷，化學結構式見圖1。相關成果已獲國家級發明專利（專利號：ZL 2019 1 0261971.4）。

圖1 憂遁草中3種黃酮苷的化學結構式（A為肥皂草苷，B為夏佛塔，C為苷牡荊苷）

2、憂遁草黃酮苷對上皮性卵巢癌細胞的增殖影響

CCK-8 實驗結果顯示，和空白組相比，經3 種不同憂遁草黃酮苷提取物處理24 h 后，牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞具有明顯增殖抑制作用（P<0.05），而肥皂草苷、夏佛塔苷對上皮性卵巢癌細胞無明顯增殖抑制作用（圖2）。牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞SKOV3、OVCAR3、A2780 的IC50值分別為33.777 μg/μl、34.114 μg/μl、31.968 μg/μl。這說明牡荊苷對上皮性卵巢癌具有抗癌活性，后續研究以牡荊苷為研究對象。

圖2 憂遁草中黃酮苷提取物對上皮性卵巢癌細胞的增殖影響(A為肥皂草苷，B為夏佛塔苷，C為牡荊苷)

3、牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞SKOV3、A2780、OVCAR3中Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達的影響

與空白組相比，經牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細胞SKOV3、A2780、OVCAR3 組Beclin-1 mRNA 相對表達量增加，Bcl-2 mRNA 相對表達量降低，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。后續研究以SKOV3為研究對象。

表1 憂遁草提取物牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞Beclin-1、Bcl-2 mRNA表達的影響

4、牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞SKOV3 的生長抑制作用

以不同濃度的牡荊苷（0、20、30、40 μg/μl）分別處理卵巢癌SKOV3 細胞24 h 后，使用Annexin V Binding Apoptosis Assay Kit 試劑盒進行檢測憂遁草提取物牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞的生長抑制作用。結果顯示：隨著牡荊苷濃度的增加，其對上皮性卵巢癌細胞SKOV3 的生長抑制作用越顯著（P<0.01）。見圖3。

圖3 憂遁草黃酮苷提取物牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞的生長抑制作用（A為流式細胞檢測圖，B為細胞凋亡率柱狀圖）

5、憂遁草提取物牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞SKOV3中Beclin-1、Bcl-2蛋白表達的影響

經牡荊苷處理后，通過Western-Bolt技術檢測空白組和藥物組中Beclin-1、Bcl-2 蛋白的表達情況，結果顯示：經牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細胞SKOV3 中Beclin-1 蛋白表達顯著升高（P<0.01），Bcl-2 蛋白表達明顯減少（P<0.01）。見圖4。

圖4 憂遁草提取物牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞中Beclin-1 和Bcl-2 蛋白表達的影響（空白對照組：加入等體積的磷酸鹽緩沖液，藥物組：Beclin-1 和Bcl-2 蛋白抗體滴液1∶5 000）

討論

晚期卵巢癌是一個多次復發的“慢性”疾病，70%的患者停止化療后3 年內復發，需要接受二線乃至多線治療，隨著復發次數增加，無進展生存期逐漸縮短，蓄積毒性日益顯著，最終發展為對鉑類耐藥［6-7］。鉑耐藥患者預后差，化療推薦非鉑方案，總有效率不足20%，中位無進展生存期3～4 個月，中位總生存時間不足12 個月。中藥有效成分在抗腫瘤方面有獨特優勢，具有多途徑、多靶點、低毒性的特點，開發新型抗腫瘤藥物已成為了卵巢癌研究的熱點。

1、憂遁草中牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞具有明顯增殖抑制作用

憂遁草是一種多年生草本植物，具有很高的藥用價值，研究表明憂遁草具有多種生物活性［5，8］，如抗炎、抗氧化、免疫調節、抑制腫瘤生長等。本研究從憂遁草中分離提純出3 種黃酮苷化合物，分別為肥皂草苷、夏佛塔苷和牡荊苷（相關成果已獲國家級發明專利，專利號：ZL 2019 1 0261971.4），CCK-8 實驗結果表明，經3 種提取物處理后，僅牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞具有明顯增殖抑制作用，肥皂草苷、夏佛塔苷無明顯增殖抑制作用，說明憂遁草中黃酮苷化合物的異質性。

2、憂遁草中牡荊苷通過促進卵巢癌細胞凋亡發揮抗腫瘤作用

細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種主要形式，在調節多細胞生長、發育和維持細胞穩定數量過程中發揮重要作用［9-10］，細胞凋亡一旦受抑制，就會導致腫瘤的發生和進展［9，11］。研究發現Bcl-2 家族是細胞凋亡的關鍵調節因子，定位于線粒體、內質網及核膜的細胞質上［12］，Bcl-2 在多種腫瘤細胞表達升高，通過抑制細胞程序性死亡，促進癌癥的發生［10，13］。本研究結果顯示，牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞具有明顯增殖抑制作用（P<0.05），并隨著牡荊苷濃度的增加，生長抑制作用越顯著（P<0.01），表明牡荊苷的生長抑制作用呈劑量-時間依賴性；經牡荊苷處理后，上皮性卵巢癌細胞Bcl-2 mRNA 相對表達量降低（P<0.01），Bcl-2 蛋白表達明顯減少（P<0.01）。可見，憂遁草中牡荊苷通過促進細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，這與Zhao 等［14］研究結論一致。同樣，也有研究發現憂遁草提取物對MCF-7 乳腺癌細胞具有抗增殖活性，可有效縮小4T1 乳腺癌小鼠模型腫瘤體積［15］，另外，也有研究證實憂遁草提取物可影響宮頸癌Hela 細胞的增殖，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡［16］。

3、憂遁草中牡荊苷通過調節Bcl-2 與Beclin-1 的相互作用控制卵巢癌細胞自噬，促進細胞凋亡

細胞自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡［17］，是一把雙刃劍，具有保護和破壞作用，一方面通過溶酶體途徑去除受損的細胞器、有毒代謝物和病原體，并產生能量維持細胞的生存，另一方面，細胞內重要成分的過度自我消化和降解也會導致細胞死亡［13］。細胞自噬與腫瘤的關系非常密切，在腫瘤發生的初期階段，細胞自噬可抑制腫瘤的發生，隨著腫瘤進展，自噬可促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡、促進腫瘤細胞發生轉移，還可通過促血管生成促進腫瘤細胞生長［9，11］。

Beclin-1是第1個被發現參與自噬過程的基因，定位于人類第17q21 號染色體，在自噬中發揮核心作用［17］，編碼Beclin-1 蛋白，是啟動自噬體形成的必需蛋白，調控自噬前體的形成［9，17］。Beclin-1 最初是作為Bcl-2 的交互蛋白被分離出來，近年來研究發現Bcl-2通過與Beclin-1相互作用發揮抗自噬作用，Beclin-1/Bcl-2 復合物在細胞中起著變阻器功能，Bcl-2不僅通過與含有BH3結構域的促凋亡蛋白結合來抑制細胞凋亡，而且通過與Beclin-1 的BH3 結構域結合，調節生長因子信號，調節自噬，BH3結構域可能是一個共同的結構基序，Bcl-2家族成員通過該結構域識別并雙重調節凋亡和自噬分子［11，17］，抗凋亡蛋白Bcl-2與自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是研究細胞凋亡與自噬機制的潛在靶點。

本研究采用Bcl-2、Beclin-1 作為標志物，發現牡荊苷對上皮性卵巢癌細胞增殖有顯著抑制作用，藥物組Bcl-2基因相對表達量降低，說明牡荊苷可能在基因水平調控細胞增殖，誘導細胞凋亡；牡荊苷作用后腫瘤細胞Beclin-1 基因相對表達量升高，提示Beclin-1 基因可能通過參與自噬，加速了細胞凋亡的進程。通過Western Blot 法檢測細胞中Bcl-2、Beclin-1 蛋白表達情況，發現藥物組卵巢癌細胞Bcl-2 蛋白表達量降低，Beclin-1 蛋白表達量升高，說明牡荊苷在蛋白質水平同樣影響了卵巢癌細胞的增殖活性，加速了腫瘤細胞的凋亡。可見，Bcl-2/Beclin-1 復合物可能是一個變阻器，通過調節Bcl-2 與Beclin-1 的相互作用，不僅控制細胞自噬水平，而且控制自噬基因依賴性細胞死亡。

綜上所述，本研究結果支持憂遁草黃酮苷提取物牡荊苷具有抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖的作用，通過降低Bcl-2 基因和蛋白的表達，升高Beclin-1 基因和蛋白的表達來控制細胞自噬，促進細胞凋亡，達到抑制腫瘤發展的作用。提示抗凋亡蛋白Bcl-2 與自噬蛋白Beclin-1 的相互作用是上皮性卵巢癌治療的潛在靶點，為開發憂遁草抗腫瘤藥用價值提供了基礎依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突