應(yīng)用思維導(dǎo)圖構(gòu)建人血白蛋白含量測(cè)定方法的教學(xué)研究*

司鑫鑫，張 曉，付 免，李婷婷，馬衛(wèi)興

(江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一種重要的高分子有機(jī)物，是由氨基酸通過肽鍵連接而成的含氮高分子化合物。蛋白質(zhì)的含量測(cè)定是生物化學(xué)分析的一項(xiàng)基礎(chǔ)工作，也與食品、營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥、化工材料等領(lǐng)域的研究密切相關(guān)。目前蛋白質(zhì)的含量測(cè)定方法較多，不同種類蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)等不同，應(yīng)選擇適宜的并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證的含量測(cè)定方法，常見的如凱氏定氮法、雙縮脲法、福林酚法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外吸收法等。

人血白蛋白(albumin)是人血漿含量最多的蛋白質(zhì)，作為一種從健康人血液中提取的藥物制劑，臨床主要用于增加循環(huán)血容量和維持體內(nèi)膠體滲透壓。其作為一種靜脈輸注藥物可直接注入人體，在臨床應(yīng)用廣泛，主要用于治療急癥患者，例如嚴(yán)重失血?jiǎng)?chuàng)傷、嚴(yán)重?zé)齻鸬牡脱萘啃菘恕⒛X水腫或肝硬化及腎臟疾病引起的水腫或腹水等[1-2]。由于該血液制品的來源特殊，對(duì)于制劑中白蛋白含量的檢測(cè)及整體制劑質(zhì)量的控制要求和相應(yīng)的檢測(cè)效率要求逐漸增加。其中，蛋白含量是人血白蛋白等血液制品的關(guān)鍵性生化指標(biāo)[3]。《中國藥典》2015版通則0731明確了人血白蛋白產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法，目前，國內(nèi)被《中國藥典》收載的用于人血白蛋白蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法主要有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法等5種[4]。此外，本文搜集整理了近幾年有關(guān)人血白蛋白含量測(cè)定的文獻(xiàn)，并對(duì)這些方法進(jìn)行了分析，按人血白蛋白的不同特性進(jìn)行了歸類整理，最終匯總得到了基于人血白蛋白的光學(xué)特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等而建立的六大類分析方法。

蛋白質(zhì)類藥物分析是生物藥物分析課程的重要組成部分之一，其內(nèi)容邏輯性強(qiáng)、知識(shí)量大，學(xué)生普遍反映學(xué)習(xí)難度較大。教學(xué)工具的不斷改進(jìn)與實(shí)踐，在提高教學(xué)效果方面發(fā)揮著重要作用。思維導(dǎo)圖教學(xué)法作為一種新型教學(xué)模式，是一種符合人類大腦記憶空間的放射性特點(diǎn)的創(chuàng)新教學(xué)手段，可由一個(gè)中心主題連接相關(guān)聯(lián)的各級(jí)主題，逐級(jí)向外擴(kuò)展，圖文并茂地展示主題，有助于制定更加科學(xué)合理的學(xué)習(xí)方案[5]。本研究將思維導(dǎo)圖引入生物藥物分析課程教學(xué)，以“蛋白質(zhì)類藥物-人血白蛋白的含量測(cè)定”教學(xué)內(nèi)容為例，借助思維導(dǎo)圖對(duì)教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行立體設(shè)計(jì)，構(gòu)建了層次分明的知識(shí)框架，構(gòu)建了人血白蛋白基于光學(xué)特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度特性、免疫特性等特性而建立的分析方法(圖1)，將瑣碎、繁雜的知識(shí)點(diǎn)串聯(lián)起來，幫助學(xué)生理解和記憶，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣，提高學(xué)生發(fā)散性思維能力，顯著提高教學(xué)效果，值得推廣。

圖1 構(gòu)建人血白蛋白含量測(cè)定方法的思維導(dǎo)圖Fig.1 Mind map of human serum albumin content determination method

1 光學(xué)特性

1.1 吸光特性

人血白蛋白是人血漿中的一種蛋白質(zhì)，氨基酸是組成蛋白質(zhì)的最小單位，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈，是一條或多條多肽鏈組成一個(gè)蛋白質(zhì)生物大分子。人血白蛋白由585個(gè)氨基酸組成的一條多肽鏈，其中蛋白質(zhì)組成中含有芳香氨基酸，如酪氨酸、色氨酸等，這些芳香氨基酸中的芳環(huán)具有紫外吸光特性，利用這一吸光特性可建立紫外分光光度法用于人血白蛋白含量測(cè)定[6]。人血白蛋白最大吸收波長(zhǎng)在280 nm處，其濃度在0.2～2 mg/mL范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于人血白蛋白制劑含量測(cè)定[7]。基于人血白蛋白的上述紫外吸收特性，結(jié)合高效液相色譜的分離功能，采用Hi-Pore RP-318型蛋白柱，流動(dòng)相為pH 6.4的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，可用于人血白蛋白的定量分析[8]。

1.2 旋光特性

旋光度法測(cè)定蛋白含量主要是基于當(dāng)平面偏振光通過含有某些光學(xué)活性物質(zhì)的液體或溶液時(shí)，能引起旋光現(xiàn)象，使偏振光的振動(dòng)平面向左或向右旋轉(zhuǎn)。人血白蛋白為左旋性物質(zhì)，使用241MC-旋光儀，采用鈉光譜D線，波長(zhǎng)589 nm，測(cè)定管長(zhǎng)1 dm，室溫下測(cè)定，在濃度40～200 mg/mL與旋光度值呈良好的線性關(guān)系，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)旋光度的回歸方程計(jì)算人血白蛋白的含量[9]。

1.3 折光特性

折光率法與旋光度法一樣也是早期用于檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的一種方法。折光率是物質(zhì)的一種物理常數(shù)，不同的物質(zhì)具有不同的折光率，人血白蛋白作為一種生物大分子，具有自己特定的折光率。使用WYY-1型醫(yī)用折射儀，人血白蛋白濃度在5.0～20.0 g/dL時(shí)線性關(guān)系良好，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)旋光度的回歸方程計(jì)算人血白蛋白的含量[10]。

2 配位特性

人血白蛋白的多肽鏈含有585個(gè)氨基酸，通過肽鍵(-CO-NH-)連接而形成具有類似雙縮脲結(jié)構(gòu)的特性，具有配位特性，在堿性溶液中與二價(jià)銅離子形成紫紅色絡(luò)合物，在一定濃度范圍內(nèi)顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，以對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 采用比色法即可測(cè)定供試品中人血白蛋白含量，可用于人血白蛋白注射液的含量測(cè)定[11]，中國藥典2015年版三部也是采用本法進(jìn)行檢測(cè)。

3 離子特性

由于蛋白質(zhì)表面離子化側(cè)鏈的存在，蛋白質(zhì)帶凈電荷，每個(gè)蛋白都存在一個(gè)pH使它的表面凈電荷為零即等電點(diǎn)，因此蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象[12]。當(dāng)?shù)鞍椎入婞c(diǎn)(pI)與pH值相等時(shí)，該蛋白質(zhì)極性基團(tuán)解離的正負(fù)離子數(shù)相等，凈電荷為0。在某一pH溶液中當(dāng)pH>pI時(shí)該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，反之pH

人血白蛋白也具有特定等電點(diǎn)，在較高pH下羧基解離成為人血白蛋白陰離子，在較低pH下氨基質(zhì)子化形成質(zhì)子化的人血白蛋白陽離子。在酸性條件下人血白蛋白陽離子可與馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行離子締合形成藍(lán)色締合物，在595 nm處有吸收峰，人血白蛋白含量在5～25 μg范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于人血白蛋白制劑含量測(cè)定[14]。

4 分解特性

人血白蛋白與其它蛋白質(zhì)一樣，是含氮有機(jī)生物大分子，可與濃硫酸和催化劑一同加熱消化分解產(chǎn)生硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，并換算成人血白蛋白含量，即含氮量*6.25=蛋白含量，這種方法就是凱氏定氮法。凱氏定氮法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，常將本法作為人血白蛋白含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于新方法學(xué)開發(fā)的評(píng)價(jià)比較[15-16]。

5 密度屬性

人血白蛋白具有密度屬性，可用密度儀測(cè)定血液制品中的人血白蛋白含量[13-14]，即不同濃度的人血白蛋白溶液具有特定的密度，通過測(cè)定供試品密度的物理性質(zhì)，建立一種密度與人血白蛋白含量的關(guān)聯(lián)，可用于人血白蛋白制劑的含量測(cè)定[17]，使用密度儀測(cè)定時(shí)樣品不需稀釋， 適合于高濃度人血白蛋白含量檢測(cè)。

6 免疫特性

人血白蛋白具有免疫特性，將人血白蛋白視作抗原，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種高靈敏度的雙抗體夾心試驗(yàn)技術(shù)，可用于測(cè)定人血白蛋白含量[18]。該方法的大致流程包括，將人血白蛋白抗體結(jié)合到固相載體，將待測(cè)抗原與之反應(yīng)，再加入相應(yīng)的酶標(biāo)記抗體，最后加酶底物的顯色液，顏色深淺和樣品中蛋白含量呈線性關(guān)系(0～0.39 mg/mL)，從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)[19-20]。

7 結(jié) 語

不同種類蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)等不同，應(yīng)選擇適宜的并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證的測(cè)定方法。人血白蛋白具有多種特性，本研究借助思維導(dǎo)圖這種可視化、簡(jiǎn)單易用的有效的教學(xué)工具，總結(jié)了基于光學(xué)特性、配位特性、離子特性、分解特性、密度屬性和免疫特性而建立的不同的分析方法，可為設(shè)計(jì)人血白蛋白含量檢測(cè)方法的教學(xué)分析提供新思路，適合于生物藥物分析課程的特點(diǎn)，值得在今后的其他生物藥物分析教學(xué)中進(jìn)一步推廣應(yīng)用。