基于響應面法對衛紅花中紅花黃色素提取條件的優化*

王婷婷，王鑫蒙，李金平，蘇亞東，李 爽， 邢沂海，李保林，張 偉，郭 嬌

(1 新鄉學院化學與材料工程學院，河南 新鄉 453003； 2 鑫福林衛紅花種植專業合作社，河南 新鄉 453003)

衛紅花又名黃藍花、紅藍花、草紅花及紅花草，為菊科植物紅花的干燥花。衛輝衛紅花為“豫北三花”之一，在衛輝市有2000多年的栽培歷史，并以其“量高質佳、蕊長色紅、手抓油潤、勁攥不折、藥香撲鼻”的特征馳名全國，并在國際市場上享有盛譽，為全國農產品地理標志[1-2]。

衛紅花的可利用資源主要集中在紅花籽和花冠，紅花籽的經濟價值主要在于提取紅花籽食用油，紅花籽食用油具有穩定血壓，降低膽固醇等作用[3]；紅花花冠含豐富的天然紅花黃色素和紅色素，可用于提取色素。紅花中紅花黃色素含量最高，黃色素中又以羥基黃色素A含量最高。紅花黃色素易溶于水，一般用作食用天然色素，著色效果好，在食品體系中性質穩定，且兼具治療心腦血管疾病、降血脂、抗氧化等活性功能[4]，具有較大的市場潛力，多年來一直是科研的熱點。

1 紅花黃色素的提取材料與方法

1.1 材料與儀器

衛紅花，鑫福林衛紅花種植專業合作社；對照品羥基紅花黃色素A，中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇，天津市光復科技發展有限公司，分析純；0.2 μm水系微孔過濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司；定性濾紙，杭州特種紙業有限公司。

Scientz-IID超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司；ME104EV02電子天平，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；KQ-100VDV雙頻數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1600紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅花黃色素的提取

干燥紅花粉碎后過40目篩，準確稱取1.00 g紅花粉末與錐形瓶中，以蒸餾水為提取溶劑，預浸泡2 h，以液料比為 10:1(V/w)，溫度25 ℃，超聲(100 W，45 kHz)提取 20 min，提取一次，用布氏漏斗過濾，取上清液過0.2 μm微孔濾膜，定容并稀釋一定倍數后，在403 nm波長處測定其吸光度[5]，并將其結果帶入公式(1)計算提取率。

1.2.2 羥基紅花黃色素A的標準曲線的測定

準確稱量1.5 mg羥基紅花黃色素A對照品，置于10 mL容量瓶并加蒸餾水稀釋至刻度線；分別精密量取羥基紅花黃色素A對照品溶液0.5、0.8、1.0、1.3、1.6、2.0 mL于5 mL量瓶內加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻后即得到不同濃度的羥基紅花黃色素A溶液。使用紫外可見分光光度計以蒸餾水為空白，在403 nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標，羥基紅花黃色素A濃度為縱坐標繪制得到標準曲線[5]。由羥基紅花黃色素A濃度和吸光度得到的回歸方程為y=0.0829x-0.0036，R2=0.9995，y的單位為mg/mL。

1.2.3 紅花黃色素含量計算[6]

(1)

式中：f—稀釋倍數

A—403 nm處吸光度

V—濾液總體積/mL

m—干紅花質量/g

1.2.4 黃色素提取單因素試驗

設置不同梯度的超聲時間(20，30，40，50，60 min)、超聲溫度(20、40、50、60、70、80 ℃)、提取次數(1、2、3次)和液料比為V(蒸餾水)：w(紅花)=6、8、10、12、15、 20 mL/g，以黃色素提取率為評價指標，考察提取溫度、提取次數、提取時間及液料比對紅花黃色素提取的影響[7]。

1.2.5 黃色素提取條件優化試驗

在單因素試驗基礎上，運用Design Expert 11軟件程序根據Box-Behnken試驗設計原理，以紅花黃色素的提取率(Y)為響應值，以對紅花黃色素提取率影響顯著的4個因素超聲時間(X1)、液料比(X2)、提取溫度(X3)和提取次數(X4)為考察因素，Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 紅花黃色素提取工藝條件優化 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test for optimization of extraction conditions of safflower yellow pigment

2 紅花黃色素的提取結果與分析

2.1 單因素實驗紅花黃色素提取工藝的優化

2.1.1 超聲時間對紅花黃色素提取率的影響

紅花黃色素的提取率在超聲提取30 min內達到最大(圖1)，提取時間超過30 min之后提取率逐漸下降，說明30 min后提取時間過長導致黃色素被破壞，因此長時間的提取在生產過程中不僅會延長生產周期，而且會增加能耗，使生產成本增加，所以提取時間30 min較為適宜。

圖1 不同提取時間下紅花黃色素的提取率Fig.1 Extraction rate of safflower yellow pigment under different extraction time

2.1.2 液料比對提取率的影響

如圖2所示，液料比在10:1之前由于溶劑量較小不能將紅花粉末潤濕，所以提取率很低，液料比在10:1之后，由于溶劑量不斷增加紅花樣品得到充分潤濕，提取率有一定程度的提高，且變化較為平穩，說明紅花黃色素擴散體系達到平衡，在料液比為12:1之后再增加溶劑用量會增加生產成本，因此在確保提取率的條件下選擇適宜溶劑用量[8]，故料液比為12:1(V/w)時提取率最大。

圖2 不同液料比下紅花黃色素的提取率Fig.2 Extraction rate of safflower yellow pigment at different liquid-solid ratio

2.1.3 超聲提取溫度對紅花黃色素提取率的影響

如圖3所示，隨著超聲溫度不斷升高，紅花黃色素的提取率先增加后減少，當溫度升到40 ℃時，紅花黃色素提取率最高。當溫度持續升高時，紅花黃色素提取率反而降低，說明了紅花黃色素隨著加熱時間增長受到破壞，熱穩定性較差，因此選擇紅花黃色素適宜超聲提取溫度為40 ℃。

圖3 不同提取溫度下紅花黃色素的提取率Fig.3 Extraction rate of safflower yellow pigment at different temperature

2.1.4 提取次數對提取率的影響

如圖4所示，提取2次時紅花黃色素的提取率達到最大，2次之后紅花黃色素的提取率沒有提高，說明紅花黃色素2次可以被提取完，持續增加提取次數也不能提高提取率，從生產角度考慮，為了降低生產成本，選擇提取次數2次時提取率最高。

圖4 不同提取次數下紅花黃色素的提取率Fig.4 Extraction rate of safflower yellow pigment at different extraction times

2.2 響應面分析實驗

2.2.1 實驗設計及結果

運用Design Expert 11軟件對表2中數據進行擬合，得回歸方程：

表2 紅花黃色素提取工藝條件優化 Box-Behnken實驗結果與分析Table 2 Box-Behnken test results and analysis of optimization of extraction conditions of safflower yellow pigment

續表2

對上述回歸方程進行方差分析，得到結果表見表3。

表3 響應面實驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

續表3

2.2.2 響應面分析

超聲提取時間、液料比、提取溫度和提取次數交互作用對紅花黃色素提取率影響的響應面曲線及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用紅花黃色素提取率影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface and contour of the interaction of various factors on the extraction rate of safflower yellow pigment

由圖5可知，當固定超聲提取時間，隨著液料比、提取次數、溫度的增大，紅花黃色素的提取率都是呈現先增加后降低的趨勢，液料比在11～13(V/w)、提取時間在25～35 min時等高線為閉合的橢圓形而且響應面呈凸形，說明提取時間和液料比的交互作用具有最大值；提取次數在1.5～2.5次、時間在25～35 min時等高線未閉合但是響應面呈凸形，說明二項式提取次數影響大；提取溫度在32～38 ℃的范圍、時間在25～ 35 min時等高線為閉合的橢圓形而且響應面呈凸形，說明提取時間和提取溫度的交互作用具有最大值；上述分析和表3中的顯著性一致。

利用Design Expert 11軟件對所得的回歸方程進行回歸分析，確定最佳工藝參數時間31.706 min、料液比13.671(V/w)、提取溫度36.576 ℃、提取次數2.144次，此時紅花黃色素提取率預測值為37.768%。為了方便實際操作，將最佳工藝參數修改為提取時間32 min、料液比13.5(V/w)、提取溫度37 ℃、提取次數2次，在此最優條件下，紅花黃色素的提取率為36.95%，與模型預測值(37.768%)較一致，驗證了模型的可靠性。

3 結 論

通過對超聲時間、料液比、提取溫度、提取次數 4 個因素進行單因素試驗，再通過 Design Expert 軟件對紅花黃色素提取率響應值進行回歸，得出提取次數和液料比對結果影響顯著。通過單因素實驗和響應曲面法確定紅花黃色素提取的最佳工藝參數：提取時間32 min、料液比13.5(V/w)、提取溫度37 ℃、提取次數2次，在此最優條件下，紅花黃色素的提取率為36.95%。

本研究采用超聲波輔助水提取紅花黃色素操作方法簡單、成本低，確定了工業化合理提取紅花色素的理想模型，為衛紅花的深加工和其色素作為功能產品在食品添加中的應用提供了基礎依據。