XAD-7HP樹脂純化款冬花多糖工藝研究*

韓毅麗，張 澍，裴曉麗

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619)

款冬花(Farfarae Flos)為菊科(Compositae)款冬屬植物款冬(Tussilago farfara L.)的干燥花蕾，性辛溫，味微苦，歸肺經(jīng)。主要產(chǎn)自陜西、山西、河南、甘肅等地。具有潤肺下氣、止咳化痰等功效，主要活性成分為黃酮類、萜類、多糖類、生物堿類，其中多糖類還具有抗腫瘤等活性，是研究的主要活性成分之一，并且多糖的純度不同，其活性不同，因此款冬花中多糖的純化，對于款冬花多糖的研究具有重要的實(shí)際意義[1-2]。目前，款冬花多糖的主要純化方法有鹽酸法、三氯乙酸法、SEVAGE法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶結(jié)合SEVAGE法、活性炭法、雙氧水法、反膠束溶液法、大孔樹脂法等，純化效果較好的為木瓜蛋白酶結(jié)合SEVAGE法和大孔吸附樹脂法，且多糖純化常用大孔吸附樹脂多為S-8型、D-101型、AB-8型、LS-206型、HPD-100型、XAD-16型等樹脂，XAD-7HP型樹脂的純化工藝未見報道[2-8]。本論文采用單因素法考察了弱極性XAD-7HP型大孔吸附樹脂純化款冬花多糖的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

款冬花藥材(批號：200101),山西元和堂中藥有限公司；XAD-7HP吸附樹脂,山西慧德易科技有限責(zé)任公司；蒸餾水(生產(chǎn)批號：201902237103SJ),山西娃哈哈昌盛飲料有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸,均為分析純,天津市北辰方正試劑廠；紫外-可見分光光度計(TU-1810),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 款冬花粗多糖的制備

將款冬花粉碎，采用95%乙醇為提取劑，按1:10 (g:V)的料液比，回流脫脂2次，每次2 h，過濾，揮干乙醇備用[3]。

精密稱取脫脂后的款冬花藥材20 g，加入圓底燒瓶，按照1:20的料液比，加入蒸餾水400毫升，80 ℃加熱回流1 h，過濾，再向圓底燒瓶中加入400 mL的蒸餾水，80 ℃加熱回流 1 h，過濾，合并濾液，90 ℃濃縮至30 mL，采用Sevage試劑(氯仿:正丁醇為4:1)[4]除蛋白，直至不再有白色沉淀出現(xiàn)。將脫蛋白后的款冬花粗多糖提取液，加入三倍體積的無水乙醇，靜置過夜后抽慮。揮干溶劑，即得粗多糖。

1.2.2 多糖的含量測定

(1)對照品溶液的制備

精密稱取D-無水葡萄糖對照品14.1 mg放入小燒杯，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶，搖勻，得濃度為0.141 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

(2)測定波長的選擇

精密移取上述對照品溶液0.0、0.5 mL，分別置于10 mL比色管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，放置2 min，搖勻，沸水浴顯色20 min，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在波長為400～600 nm進(jìn)行掃描，得最大吸收波長為490 nm，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖對照吸收光譜曲線圖Fig.1 Curve of absorption spectrum of glucose reference substance

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取對照品溶液0.00、0.25、0.30、0.35、0.45、0.60、0.70 mL于10 mL比色管中，按“(2)”項下方法顯色，490 nm處測定吸光度值，結(jié)果在0.0044 ～ 0.0123 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程：A=49.37C+0.0015，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9999，結(jié)果見圖2。

圖2 葡萄糖對照標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glucose reference substance

(4)樣品含量的測定

精密稱取款冬花多糖0.5000 g，定容至100 mL容量瓶，精密移液0.08 mL于10 mL比色管中，按“1.2.2.2”項下方法顯色，490 nm處測定吸光度值，根據(jù)線性方程計算多糖濃度。

2 款冬花多糖的純化工藝研究

2.1 大孔樹脂預(yù)處理

室溫下，將XAD-7HP吸附樹脂用無水乙醇密封浸泡8 h，用去離子水洗去乙醇，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH浸泡 8 h，用去離子水洗至中性，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HC1浸泡 8 h，用去離子水洗至中性待用。

2.2 純化流程

將制備的款冬花粗多糖用蒸餾水配置成一定濃度的溶液，以一定的速度上樣至樹脂層析柱，再用一定濃度的乙醇以一定的速度洗脫。

式中：C0為提取液中多糖濃度mg/mL；Ce為濾液中多糖濃度mg/mL；Cd為洗脫液中多糖濃度mg/mL；V0為提取液體積mL；Vd為洗脫液體積；M1為提純樣液中的質(zhì)量；M2為樣液烘干后質(zhì)量。

2.2.1 上樣濃度對吸附效果的影響

取5 g經(jīng)預(yù)處理的XAD-7HP型樹脂，濕法裝柱。將濃度分別是0.9624、0.4812、0.3208、0.2406、0.1926 mg/mL的款冬花多糖提取液5、10、15、20、25 mL以相同的速度上樣。測量吸附后款冬花多糖溶液的吸光度，計算吸附率。

2.2.2 上樣速度對吸附效果的影響

配制5份相同濃度款冬花多糖提取液，分別以0.5、1、1.5、2.0、2.5 mL/min的上樣速度進(jìn)行上樣。檢測吸附后款冬花提取液的吸光度，計算吸附率。

2.2.3 不同洗脫濃度對洗脫效果的影響

當(dāng)洗脫速度為1.0 mL/min，洗脫液體積是15 mL時，以體積分?jǐn)?shù)分別為55%、65%、75%、85%、95%的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，分別計算洗脫液中款冬花多糖的吸光度，計算洗脫率。

2.2.4 不同洗脫速度對洗脫效果的影響

用上述步驟得到的最佳體積分?jǐn)?shù)的洗脫劑進(jìn)行洗脫，考察洗脫速度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min時，洗脫液中款冬花多糖的吸光度，計算洗脫率。

3 結(jié)果與分析

3.1 上樣濃度對吸附效果的影響

從圖3看到，當(dāng)上樣濃度逐漸增大時，吸附率也跟著上升，當(dāng)上樣濃度超過0.3208 mg/mL時，吸附率開始下降。這是因?yàn)樯蠘右簼舛容^低時有部分XAD-7HP樹脂未達(dá)到飽和狀態(tài)，增加多糖溶液的濃度，就增大了多糖分子與XAD-7HP樹脂的接觸機(jī)會，多糖分子就可以擴(kuò)散進(jìn)樹脂，從而增大了多糖分子被XAD-7HP樹脂吸附的機(jī)會，但是當(dāng)多糖的溶液濃度超過某一值時，XAD-7HP樹脂表面的多糖分子單分子層吸附飽和，多糖分子過多，阻礙其他多糖分子進(jìn)入樹脂內(nèi)部，影響多糖分子在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散。并且當(dāng)款冬多糖液濃度過于龐大時，會有沉淀產(chǎn)生，進(jìn)而堵塞樹脂影響吸附。所以考察純化的工藝時，樣液濃度要在0.3208 mg/mL左右。

圖3 上樣濃度對吸附效果的影響Fig.3 Effect of the above concentration on adsorption effect

3.2 上樣速度對吸附效果的影響

由圖4可以看出，當(dāng)上樣速度剛開始增加時，吸附率在增大。但是當(dāng)上樣速度增大到1.0 mL/min時，之后速度的增加導(dǎo)致XAD-7HP型樹脂的吸附時間縮短，大量的多糖類化合物還來不及被樹脂充分吸附便流出樹脂柱，降低了吸附量。綜合考慮，上樣速度應(yīng)該在1.0 mL/min左右為宜。

圖4 上樣速度對吸附效果的影響Fig.4 Effect of the above speed on the adsorption effect

3.3 不同洗脫濃度對洗脫效果的影響

從圖5中可知，洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)不同，洗脫效果也有一定程度的差異的。可以看到，洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)為65%時洗脫效果最好，洗脫率最大。所以洗脫劑的體積分?jǐn)?shù)65%為最佳。

圖5 不同洗脫濃度對洗脫效果的影響Fig.5 Effect of different elution concentrations on elution effect

3.4 洗脫速度對洗脫效果的影響

由圖6可以得到，剛開始隨著洗脫速度的增加，洗脫率明顯增大。但當(dāng)洗脫速度超過1.0 mL/min時，隨著洗脫速度的增加，洗脫率在明顯的減小，這是當(dāng)洗脫速度較慢時，能將多糖類化合物從XAD-7HP型樹脂上充分的洗脫出來，但是隨著洗脫速度的不斷增加，有大部分的多糖類化合物來不及被洗脫下來。因此，在進(jìn)行多糖溶液的洗脫時，我們應(yīng)該選擇適宜的洗脫速度，這樣可以有一個較高的洗脫率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)65%乙醇洗脫速度為1.0 mL/min時，可以得到較高洗脫率的效果。

圖6 洗脫速度對洗脫效果的影響Fig.6 Effect of elution speed on elution effect

3.5 款冬花粗多糖的純化

配制0.3208 mg/mL的款冬花粗多糖溶液，以1.0 mL/min的速度上樣，采用 65%的乙醇以1.0 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，得最佳純化多糖溶液，平行測定3次，計算得多糖純度為72.98%。

4 結(jié) 論

大孔吸附樹脂(MACROPROUS ADSORPTION RESIN，MAR)是一類重要的高分子聚合物分離材料，已成為中藥產(chǎn)業(yè)帶動面最廣的共性技術(shù)和關(guān)鍵技術(shù)，但在中藥多糖的大分子分離方面還處于起步階段[2]。XAD7HP吸附樹脂屬弱極性吸附樹脂，可有效吸附芳香類、酚類等脂類有機(jī)化合物，可以有效去除多糖色素，經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)可以得到XAD-7HP型樹脂純化款冬花多糖的最佳工藝為上樣液濃度0.3208 mg/mL、上樣速度 1.0 mL/min、洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)65%，洗脫速度 1.0 mL/min，在上述實(shí)驗(yàn)條件下，款冬花多糖的純度達(dá)到了72.98%，純化效果顯著。XAD-7HP型樹脂具有操作簡單，溶劑消耗低，有毒溶劑殘留少，純化效率高等特點(diǎn)，為MAR分離技術(shù)和款冬花多糖的進(jìn)一步研究提供了參考信息。