GQDs@Gel納米體系的制備及其抑菌性能研究*

朱 韜，吳可馨，賀煜添，朱鳳池，楊冬芝

(徐州醫科大學新藥研究與臨床藥學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

水凝膠(Hydrogel， Gel)由大量的水和相互交聯的高分子組成，因其含水量(70%～99%)與生物組織接近而具有很高的生物相容性和高效載藥能力[1]。智能水凝膠具有特殊環境(如溫度、pH等)響應性質，成為藥物載體的首選。Zhao等[2]利用制備的智能水凝膠同時包載阿霉素和紫杉醇兩種藥物，利用腫瘤環境的弱酸環境，藥物釋放表現出明顯的腫瘤特異性。Kim等[3]制備利用水凝膠和微球的智能響應性，實現阿霉素和氟脲嘧啶在腫瘤部位的順序釋放。大部分水凝膠呈固態，在臨床應用中收到限制。基于微環境設計的可降解水凝膠發展極為迅速[4-6]。

石墨烯量子點(Graphene Quantum Dots， GQDs)是一種零維碳納米材料，優異的生物相容性和豐富的表面化學基團，使GQDs在生物醫學領域[7]受到廣泛關注。不同方法制備的GQDs具有明顯不同的化學和物理性質。Ge等[8]以聚噻吩為原料合成的GQDs具有明顯優于其他方法的性質，這種方法合成的GQD在一定激光照射下可釋放單線態氧，具有很高的醫學應用潛力。這一性質在我們在前期對GQDs抑菌性能研究中得以證實。但如何實現GQDs在疾病部位的定向釋放是需要解決的問題。

本工作中我們選取具有酸度敏感性的水凝膠包載GQDs，比較Gel在不同酸度溶液中的降解性能及GQDs的釋放行為，并研究了不同條件下GQDs@Gel的抑菌性能，結果發現，在弱酸條件下Gel發生降解從而釋放GQDs，從而表現出良好的控制釋放行為，為該復合材料在抑菌方面的應用提供了信息借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

葡聚糖70(W=70 kD)、殼聚糖(中粘度)和高碘酸鈉(99.5%),上海麥克林生化科技有限公司;5， 10， 15，20-四(4-氨基苯基)卟啉、(三苯基膦)鈀，上海阿拉丁生化科技有限公司。N，N-二甲基十二胺，3-噻吩硼酸和溴芐基溴，Alfa Aesar化學有限公司；大腸桿菌(ATCC：8739)和金黃色葡萄球菌(ATCC：29213)，北京中科質檢生物技術有限公司；瓊脂，微科曼德生物工程有限公司；酵母膏和胰蛋白胨，英國OXOID公司。

Q25掃描電子顯微鏡(SEM)，美國FEI有限責任公司；FL4600熒光分光光度計，日本島津有限公司；UV-3100型可見紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FD-1C-50真空冷凍干燥機，北京博藝康實驗儀器有限公司；TG20高速離心機，海南凱達科學儀器有限公司；DF-1型集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市環宇科學儀器廠；Thermo Scientific超純水儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 GQDs@Gel的制備與表征

GQDs的制備：參考本實驗室合成方法制備GQDs[9-10]。 1 mmol 4-溴芐基溴和1.3 mmol N，N-二甲基十二胺溶于20 mL二氯甲烷/甲醇(V:V=3:2)，N2保護下室溫攪拌12 h。將產物減壓蒸餾濃縮至約5 mL，轉移至無水乙醚，靜置得白色沉淀，經過濾、真空干燥，得到白色晶體，即化合物1。取化合物0.96 mmol 1，1 mmol 3-噻吩硼酸，4.7 mmol無水碳酸鈉和0.17 mmol 4-(三苯基膦)鈀，溶解于30 mL乙醇/去離子水 (V:V=2:1)，N2保護下加熱至90 ℃，反應6 h后產物經層析柱及薄層層析純化得白色晶體化合物2。化合物2與FeCl3(質量比4:1)分別溶解于氯仿，將化合物2的溶液滴加入FeCl3溶液中，N2保護下室溫反應48 h。經過濾、離心、甲醇洗滌3次，干燥可得暗紅色固體，即為PT2。稱取20 mg PT2，溶于40 mL去離子水，用NaOH調節pH至9～10后，溶液置于高壓反應釜，160 ℃加熱24 h。反應結束后冷卻至室溫，產物經過濾，濾液即為GQDs水溶液。

GQDs@Gel的制備：1 g高碘酸鈉滴入葡聚糖的水溶液中，避光反應6 h，經透析、干燥即得醛基交聯劑。0.02 g殼聚糖與0.05 g(5， 10， 15， 20)-四(4-氨基苯基)卟啉混和均勻，再加入GQDs量子點溶液(80 μg/ml)50 μL，醛基交聯劑50 μL，經反應即得復合水凝膠GQDs@Gel。

1.3 細菌培養

細菌培養平板的制作：LB營養瓊脂按照氯化鈉1 g/ 100 mL、胰蛋白胨1 g/100 mL、酵母浸粉0.5 g/100 mL、瓊脂1 g/100 mL溶解于去離子水中，在121 ℃、101 kPa條件下滅菌60 min后，稍冷卻后倒入細菌培養皿中，每個培養皿約 20 mL，待其凝固后，置于4 ℃冰箱中無菌保存備用。

細菌復蘇與培養：將凍存的菌種取出，于4 ℃冰箱內溶化。取5 μL菌種置于含有30 mL液體培養基的無菌試管內，于37 ℃，200 rpm恒溫搖床中傳代三次備用。將上述復蘇的菌液離心后棄上清，然后用無菌去離子水將細菌混勻，使用UV-Vis在600 nm波長下測定OD值，當OD600為0.1時菌液的濃度為2×108CFU/mL。采用常規的37 ℃和200 rpm恒溫搖床中培養。

1.4 GQDs@Gel的抑菌性能

GQDs@Gel的抑菌效果：通過考察GQDs@Gel對細菌的抑菌作用，評價GQDs在包載前后其抑菌效果。采用平板菌落計數法，以磷酸緩沖溶液(Phosphate Buffered Saline， PBS)為對照，選取劑量為4 μg GQDs@Gel溶液考察納米材料的抑菌活性。每組分別設置3個平行對照。細菌存活率=實驗組菌落數/對照組菌落數×100%。

GQDs@Gel的光動力抑菌效果：采用平板菌落計數法，分別考察GQDs@Gel在光照以及非光照條件下對大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌的抑菌效果。將實驗分為光照組與非光照組，對于光照組使用白熾燈(功率5 W；距離40 cm)照射15 min后于37 ℃恒溫培養箱內過夜培養，每組設置3個平行組。

2 結果與討論

2.1 Gel的性質表征

SEM表征(圖1)顯示，Gel呈現三維網狀結構，孔徑約 10 μm。Gel在一定條件下會發生降解，生成原產物卟啉衍生物，卟啉衍生物在480 nm有特征吸收峰。實驗考察了Gel在不同pH(5.0，6.5和7.4)下的狀態，紫外-可見吸收光譜圖及Gel的流動狀態顯示(圖2)，在酸性條件下，卟啉衍生物的吸收強度明顯提高，提示水凝膠的降解速度明顯高于中性條件，這與水凝膠呈現出的凝膠狀/流動狀之間的變換一致。

圖1 Gel的SEM表征圖Fig.1 The SEM image of Gel

圖2 Gel在不同pH環境下的降解Fig.2 The degradation of Gel in different medium

2.2 GQDs@Gel中GQDs的包載及釋放

GQDs在650 nm(Ex=400 nm)處表現出熒光特征發射峰，比較GQDs及GQDs@Gel的熒光光譜圖(圖3)可知，GQDs@Gel在同樣的位置表現出較強的熒光性能，證明Gel對GQDs的包載。

圖3 The loading and release of GQDs in GelFig.3 Online and offline mixed experimental teaching mode

通過GQDs的紫外-可見吸收光譜性質計算在Gel中的包載，包封率為98.2%，包載量為90 μg/mg。實驗同時考察了在pH=5.0、6.5、7.4的PBS介質中的GQDs的釋放情況，結果顯示GQDs@Gel在各溶液中孵育180 h時，GQDs的釋放率明顯不同。在pH=5.0的介質中GQDs釋放率達到69.4%，而在pH 6.5和7.4中的釋放率分別為42.9%和11.7%，呈現出明顯的酸度敏感性，這與Gel的分解性能一致，說明GQDs的釋放與Gel的酸度敏感性相關。這一性質為酸度敏感的藥物治療提供了可能性。

2.3 GQDs@Gel抑菌性能

文獻顯示，GQDs具有光動力抑菌性能[11-12]，實驗研究了被Gel包在后GQDs@Gel在光照及非光照條件下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。結果如圖4所示，以PBS為對照，在非光照條件下大腸桿菌的存活率分別為70.5%(pH 7.4)，12.0%(pH 6.5)和5.4%(pH 5.0)，金黃色葡萄球菌的存活率分別為76.7%(pH 7.4)，23.5%(pH 6.5)和15.2%(pH 5.0)，說明本實驗制備的GQDs@Gel本身具有抑菌效果，且抑菌效果隨溶液pH降低而增強，顯示出明顯的酸度響應性。同時，與非光照組比較，光照條件下明顯增強了GQDs@Gel對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。數據顯示分析，經GQDs@Gel處理后，光照條件下大腸桿菌的存活率為45.9%(pH 7.4)，2.7%(pH 6.5)和0.3%(pH 5.0)，金黃色葡萄球菌的存活率降低為60.2%(pH 7.4)，9.8%(pH 6.5)和2.6%(pH 5.0)。GQDs@Gel光照組與非光照組在抑菌性能上存在顯著性差異(p<0.01)，GQDs被Gel包載后仍然表現出明顯的抑菌性能，且光照可以顯著增強其抑菌能力。

圖4 不同pH條件下GQDs、GQDs@Gel抑菌效果圖Fig.4 The antibacterial effect of GQDs and GQDs@Gel in different medium

3 結 論

本工作構建了酸度條件分解的水凝膠體系，并通過包載具有光動力性質的GQDs，形成具有酸度敏感性的GQDs@Gel復合抑菌體系。通過Gel和GQDs的光學性質，考察了材料的降解性及GQDs的包載和釋放行為。不同酸度條件和光照條件下的抑菌實驗證實，GQDs@Gel對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌效果，且呈現出明顯的酸度敏感性，普通日光燈對于GQDs@Gel的抑菌效果具有明顯的增強作用。本實驗結果為抑菌藥物的開發提供了有用的信息借鑒。