麩皮紅曲發酵工藝研究

馬美榮，張坤，李洪媛，李博藝，周林艷，王小偉

(北京紅星股份有限公司，北京 101400)

紅曲霉是腐生真菌，屬真菌門、子囊菌綱、真子囊菌亞綱、曲霉目、曲霉科、紅曲霉屬[1]。紅曲霉在麥芽汁瓊脂培養基上生長良好，菌落起初為白色，老熟后變成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成紅色[2]。由其制作的紅曲可用于釀酒[3-4]、制醋[5-6]、作豆腐乳的著色劑和調味劑[7-8]。在酶制劑工業中也可用其生產糖化酶制劑[9-10]。近年來，隨著國內外學者對紅曲的深入研究，發現紅曲中有洛伐他汀類化合物、γ-氨基丁酸、麥角固醇、亞油酸、異黃酮、葡萄糖胺等有益的代謝產物，這些活性物質具有降脂、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗抑郁、預防骨質疏松等多種功效[11-13]。

麩皮為小麥最外層的表皮，小麥加工面粉后剩下的皮稱為麩皮。麩皮含有可提供曲霉生長的一切維生素、微量礦質元素及其他生長因子，是制作黑曲霉、根霉、毛霉、梨頭霉、擬內孢霉、固體酵母的主要原料[14]。近年來，一些研究者進行了利用麩皮生產紅曲的研究。張立強等采用麩皮培養紅曲，以酯化力為標準確定麩皮紅曲的最佳制作條件，并將麩皮紅曲應用于黃水的酯化以提高己酸乙酯和乳酸乙酯的含量[15]。莊桂采用黑曲霉將麩皮糖化后，進而利用糖化麩皮代替糯米進行紅曲培養以制備紅曲色素，提高了麩皮的附加值[16]。程偉等采用大米、麩皮混合料制備的酯化紅曲明顯優于大米或麩皮等單獨作為原料制備的酯化紅曲[17]。

北京紅星股份有限公司的紅曲生產是以小米或大米為原料，生產成本較高。因為麩皮比小米或大米便宜，以麩皮代替小米或大米來培養紅曲，應該可以降低生產成本。由于QB/T 5188-2017《釀造紅曲》是以糖化力作為紅曲的評價指標[18]，且紅星公司生產的紅曲主要是利用其糖化性能和產香性能參與釀酒發酵，因此在研究中以糖化力指標作為麩皮紅曲質量的評價標準。本研究通過影響麩皮紅曲糖化力的單因素試驗研究及正交試驗研究，確定合適的發酵工藝條件；分析麩皮紅曲與大米紅曲的風味物質含量并進行比較；對兩種紅曲的成本進行分析，評價麩皮紅曲生產的經濟可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

紅糖、大米、玉米面：市售；麩皮、酒糟、酒尾：北京紅星股份有限公司釀造車間；紅曲霉：北京紅星股份有限公司。

1.2 主要試劑

乙醇：分析純，北京化工廠；乙酸、無水乙酸鈉：均為分析純，天津市大茂化學試劑廠。

1.3 主要儀器與設備

HY-60S恒溫搖床 武漢匯誠科技有限公司；HPS-250生化培養箱 哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；HH.S21-Ni6水浴鍋 北京長安永利科學儀器有限公司；GTR16-2離心機 北京時代北利離心機有限公司；GC-2010 plus氣相色譜儀 日本島津公司。

1.4 方法

1.4.1 酒糟水的制備

取100 g酒糟置于1 L水中，加熱至沸，保持10 min，過濾，濾液加水補足至1 L。

1.4.2 紅糖酒糟水培養基的制備

上述制備的酒糟水1 L，加入50 g紅糖，溶解，滅菌備用。

1.4.3 紅曲霉液體種子培養

將紅曲霉斜面接種于紅糖酒糟水培養基中，30 ℃、120 r/min搖床培養2 d。

1.4.4 麩皮紅曲培養

每500 mL三角瓶中加入30 g麩皮，并加入30 mL水，拌勻，121 ℃高壓滅菌30 min。降溫冷卻至30 ℃左右時，以20%的接種量接入培養好的紅曲霉種子，在30 ℃培養，培養成熟后得到麩皮紅曲。

1.4.5 大米紅曲培養

大米室溫下浸泡4～6 h，在500 mL三角瓶內裝入50 g浸泡后的大米，121 ℃滅菌30 min。冷卻后接入10%的液體種子，30 ℃培養8 d。

1.4.6 紅曲糖化力測定

稱取5 g紅曲樣品，加入90 mL水和10 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進行淀粉酶解糖測定，測定方法參照斐林定糖法[19]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗標準葡萄糖溶液的體積(mL)；V表示加麩曲糖化液后消耗標準葡萄糖溶液的體積(mL)；C表示標準葡萄糖溶液的濃度(g/mL)。

1.4.7 不同培養條件對麩皮紅曲糖化力的影響

以1.4.4為基礎，進行不同培養基、初始加水量、培養溫度及發酵時間等參數試驗，探究其對紅曲糖化力的影響。

1.4.7.1 不同培養基的影響

麩皮培養基：麩皮∶水為100∶100；麩皮酒尾培養基：麩皮∶水∶酒尾為100∶100∶20；麩皮玉米面培養基：麩皮∶水∶玉米面為80∶100∶20。其他條件為培養溫度30 ℃、培養時間7 d。

以選擇的培養基進行1.4.7.2～1.4.7.6及1.4.8試驗。

1.4.7.2 不同裝料量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入10，30，50 g麩皮，其他條件為料水比1∶1、培養溫度 30 ℃、培養時間7 d。

1.4.7.3 不同培養時間的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比為1∶1，培養溫度為30 ℃，分別在培養時間6，7，8，9 d取樣分析。

1.4.7.4 不同初始加水量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比分別為0.8∶1、1∶1、1.2∶1、1.4∶1，培養溫度為 30 ℃，培養時間為7 d。

1.4.7.5 不同接種量的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，接種量分別為10%、15%、20%、25%、30%，其他條件為料水比1∶1、培養溫度30 ℃、培養時間7 d。

1.4.7.6 不同培養溫度的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入30 g麩皮，料水比為1∶1，分別在25，30，35，40 ℃培養，培養時間7 d。

1.4.8 正交試驗設計

通過單因素試驗對紅曲糖化力影響較大的裝料量、初始料水比、接種量、溫度進行三水平正交試驗設計，優化紅曲培養條件[20-21]。

1.4.9 紅曲風味物質分析

以干重計稱取5 g紅曲，置于250 mL磨口三角瓶中，加入100 mL 70%乙醇室溫下浸泡2 d，提取液置于50 mL離心管中，3000 r/min，10 min，取上清液進行風味物質分析。

風味物質的測定：采用氣相色譜法檢測風味物質的含量。色譜條件參照楊強等[22]的方法并略作修改：LZP-930石英毛細管色譜柱(50 m×0.32 mm×1.00 μm)；氫火焰離子化檢測器(flame ionization detector，FID)，檢測器溫度230 ℃；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，再以20 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；載氣為氮氣(N2)；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1∶30。根據保留時間定性[23]，采用內標法定量，內標物為乙酸正戊酯(質量濃度0.117 g/L)。

1.5 數據處理

采用Excel分析軟件進行數據處理及作圖分析。

2 結果與討論

2.1 不同培養條件對麩皮紅曲糖化力的影響

2.1.1 不同培養基對糖化力的影響

培養基是微生物生長、代謝目的產物的物質基礎。不同的培養基組成會極大影響代謝產物的合成。從幾種培養基的培養來看，不同培養基的生長速度差別較大，麩皮玉米面培養基生長最快，麩皮酒尾培養基生長最慢。這可能是因為培養基加玉米面后營養更豐富，有利于紅曲霉生長，而酒尾中含有乙醇、有機酸等物質，培養初期可能會對紅曲霉的生長有一定的抑制作用。

圖1 不同培養基對糖化力的影響Fig.1 Effect of different media on saccharifying power

由圖1可知，幾種培養基中，采用麩皮酒尾培養基的糖化力最高，后續試驗采用麩皮酒尾培養基進行工藝優化培養試驗。

2.1.2 不同發酵時間對糖化力的影響

圖2 不同發酵時間對糖化力的影響Fig.2 Effect of different fermentation time on saccharifying power

發酵時間短，發酵不完全，發酵時間過長，發酵指標不一定增加較多，甚至可能降低，從發酵指標、設備利用率等方面考慮，確定合理的發酵時間非常必要。由圖2可知，麩皮紅曲的糖化力隨著發酵時間的延長出現先上升后下降的趨勢，發酵7 d 時效果最好，發酵時間長，紅曲糖化力反而下降，后續試驗采用7 d發酵。

2.1.3 不同裝料量對糖化力的影響

圖3 不同裝料量對糖化力的影響Fig.3 Effect of loading volume on saccharifying power

裝料量不同，導致微生物的生長環境不同，進而影響微生物的代謝產物代謝流程。由圖3可知，從500 mL三角瓶裝料量發酵結果來看，裝料30 g的糖化力最高，裝料量少，保濕效果差，物料容易發干，影響培養；裝料量多，溶氧效果差，也影響培養效果。在本試驗條件下，裝料量以30 g效果最好。

2.1.4 不同接種量對糖化力的影響

圖4 不同接種量對糖化力的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on saccharifying power

接種量也是影響微生物發酵的重要因素之一。接種量小，發酵代謝緩慢，也容易感染雜菌；接種量過大，發酵速度過快，也會影響微生物代謝產物合成。由圖4可知，20%接種量效果最好，接種量過大，紅曲糖化力反而下降。

2.1.5 初始加水量對糖化力的影響

圖5 不同初始加水量對糖化力的影響Fig.5 Effect of initial water additive amount on saccharifying power

微生物的生長、代謝離不開水，不同微生物的生長代謝對水分的要求也不同。由圖5可知，初始加水量影響發酵效果，隨著初始加水量的增加，麩皮紅曲的糖化力也出現先增加后下降的趨勢，在本試驗條件下，初始加水量為120%時效果最好。

2.1.6 不同培養溫度對糖化力的影響

圖6 不同溫度對糖化力的影響Fig.6 Effect of different temperatures on saccharifying power

微生物的生長和代謝產物的合成是在各種酶的催化活動下進行的，而酶的催化活動受溫度的影響。由圖6可知，隨著溫度升高，紅曲的糖化力先上升后下降，以30 ℃的糖化力最高。

2.2 正交試驗

依據上述單因素試驗結果，重新選定各因素較為適宜的試驗水平范圍進行正交試驗(見表1)，試驗選定A(裝料量)、B(接種量)、C(初始加水量)、D(溫度)設計四因素三水平正交試驗確定最佳組合。

表1 麩皮紅曲制作正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment of bran red koji

表2 麩皮紅曲試驗正交水平表Table 2 The orthogonal level table of bran red koji experiment

由表2可知，對麩皮紅曲糖化力的影響因素為A>C>D>B，最佳培養條件為A(裝料量)30 g/500 mL三角瓶、B(接種量)20%、C(初始加水量)120%、D(溫度)30 ℃。

2.3 麩皮紅曲與小米紅曲風味物質分析

以氣相色譜分析麩皮紅曲、大米紅曲風味物質的差異，同時對原料麩皮、大米的風味物質進行分析，見表3。

表3 紅曲及制曲原料風味物質分析Table 3 Analysis of flavor substances of red koji and koji-making raw materials mg/kg

在采用色譜條件下，從紅曲及制曲原料中共檢測到9種風味物質，醛類2種、酯類5種、醇類2種。在兩種紅曲及麩皮、大米中，都是醛類物質含量最高，其次酯類物質含量較高。在兩種紅曲中，麩皮紅曲的醛類物質、酯類物質含量高于大米紅曲，分別高53.34%、3.82%，但醇類物質含量低于大米紅曲，約低9.08%。兩種紅曲風味物質含量的差別可能與制曲原料有關。麩皮紅曲與原料麩皮的風味物質含量相比，麩皮紅曲的酯類物質含量高于麩皮，約高18.68%，但醛類物質、醇類物質含量低于麩皮，分別約低6.36%、6.51%。大米紅曲與原料大米的風味物質含量相比，大米紅曲的酯類物質含量高于大米，約高58.63%，但醛類物質、醇類物質含量低于大米，分別約低64.02%、3.88%。

2.4 麩皮紅曲與大米紅曲成本分析

表4 麩皮紅曲與大米紅曲成本分析Table 4 The cost analysis of bran red koji and rice red koji

以麩皮2元/kg、大米4元/kg計，根據它們的出曲率計算噸曲原料直接成本。由表4可知，大米紅曲的出曲率低，但價格高于麩皮，麩皮紅曲噸成本遠低于大米紅曲噸成本，約為大米紅曲成本的37%左右。從原料直接成本上來看，麩皮紅曲具有取代大米紅曲的經濟可行性。

3 結論

經過單因素試驗及正交試驗，確定了最佳的麩皮紅曲發酵工藝條件：裝料量30 g/500 mL三角瓶、接種量20%、初始加水量120%、溫度30 ℃。

兩種紅曲及制曲原料經過風味物質分析，主要含有醛類、醇類、酯類物質，醛類物質含量最高，其次為酯類物質，兩種紅曲的風味物質含量無顯著差異。兩種紅曲風味物質含量的差別可能與制曲原料有關。

麩皮紅曲的出曲率要高于大米紅曲的出曲率，且麩皮價格遠低于大米價格，麩皮紅曲直接原料成本要遠遠低于大米紅曲，因此其具有取代大米紅曲的經濟可行性。

麩皮紅曲能否在生產上應用，首先要考察其對原酒品質的影響，所生產原酒能否滿足作為基酒或調味酒的使用要求，其次由于紅曲霉在麩皮上生長緩慢，需要實現麩皮紅曲的規模化生產，以滿足生產應用要求。