人工接種酸菜發酵工藝優化

袁先鈴，周鶯茹，鄭連強

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

四川酸菜主要是以芥菜作為加工原料，通過乳酸菌和酵母菌等微生物發酵而成的一種發酵類食品，在四川簡稱鹽漬青菜[1-2]。據史冊記載，酸菜的制作工藝已有440多年的歷史[3]。在發酵技術的研究中，歐洲的科研工作者首先開發出乳酸菌純種發酵技術，比如加拿大的考德威爾生物發酵公司率先獲得了酸菜發酵菌株專利技術[4]；國內對酸菜的研究主要是應用微生物純培養技術，比如乳桿菌的分離篩選等。傳統自然發酵依賴于單一的乳酸菌發酵[5]，從純種乳酸菌發酵技術再到直投式乳酸菌發酵技術的發展，更加明確了酸菜發酵過程中微生物的作用；技術的發展縮短了酸菜發酵的時間；改善了酸菜的風味、質地；提高了酸菜的食用安全[6-8]。吳鈺清等[9]以崇左江州鎮保安酸菜為試驗原料，發現用0.04%氯化鈣處理酸菜30 min，在4 ℃下真空保藏，酸菜的脆度最佳。趙金海等[10]研究得出酸菜在發酵劑添加量為3%，菌種比例(腸膜明串珠菌∶植物乳桿菌)為1∶2，發酵溫度為20 ℃，發酵時間為16 d的酸菜有光澤，無異味，酸味純正柔和，略帶甜味，清脆可口。張玉龍等[11]采用明串珠菌和乳酸桿菌復配出酸菜發酵劑，接入到自然發酵酸菜中進行發酵，取得了良好的酸菜成品。

本試驗以從自然發酵酸菜中篩選出的植物乳桿菌和類干酪乳桿菌為研究目標，通過單因素試驗和正交試驗對酸菜進行工藝優化，其成果對促進和加快酸菜這一傳統食品的現代化生產，縮短酸菜的生產周期，降低生產成本，改善酸菜的風味和提高酸菜的質量、工業經濟效益等均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芥菜：購于成都農家市場。

目標菌：A6植物乳桿菌、A8類干酪乳桿菌菌株(從自然發酵酸菜中分離所得菌株)。

1.2 儀器與設備

SHP-250E生化培養箱 上海培因試驗儀器有限公司；SW-CJ超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；Legend Micro 17離心機 ThermoFisher Scientific公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；泡菜壇子 景德鎮市承啟陶瓷有限公司；電磁爐 深圳綠智電磁爐有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發酵酸菜的制作

發酵酸菜制作工藝：白菜整理→清洗→切分→稱量→熱燙→冷卻→入缸→注入鹽水→人工接種→密封→發酵→成品。

1.3.2 菌株接種量的選擇

以食鹽濃度為2%，發酵溫度為30 ℃，發酵時間為20 d，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1，設置接種量為5%、6%、7%、8%、9%、10%進行乳酸菌酸菜發酵試驗。

1.3.3 發酵時間的選擇

以食鹽濃度為2%，接種量為8%，發酵溫度為30 ℃，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1，發酵時間分別為5，10，15，20，25，30 d進行乳酸菌酸菜發酵試驗。

1.3.4 鹽水濃度的選擇

以發酵溫度為30 ℃，發酵時間為20 d，接種量為8%，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1，設置鹽水濃度為2%、3%、4%、5%、6%、7%進行乳酸菌酸菜發酵試驗。

1.3.5 發酵溫度的選擇

以食鹽濃度為2%，接種量為8%，發酵時間為20 d，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1，設置發酵溫度為15，20，25，30，35 ℃進行乳酸菌酸菜發酵試驗。

1.3.6 發酵酸菜條件優化

最佳發酵條件因素水平表見表1。

表1 最佳發酵條件因素水平表Table 1 The factors and levels of optimal fermentation conditions

以試驗所分離篩選的菌株作為添加菌株，將菌株進行擴增培養，采用蔬菜培養基：分別取新鮮番茄、青瓜和包菜，清洗后在粉粹機中粉粹，用6層濾布過濾，濾液即為相應的蔬菜培養基，滅菌后備用。包菜汁與青瓜汁配比為2∶1時適宜植物乳桿菌生長；類干酪乳桿菌采用包菜汁∶胡蘿卜汁∶番茄汁為1∶1∶1時適宜生長[12]。

綜合參考文獻[13-14]，依據試驗1.3.2選擇最佳接種量，依據試驗1.3.3選擇最佳發酵時間，依據試驗1.3.4選擇最佳鹽水濃度，依據試驗1.3.5選擇最佳發酵溫度。采用L9(34)正交試驗，按酸菜發酵工藝流程接種發酵。酸菜發酵所用的容器為泡菜壇子，體積為1.2 L，裝菜量大約為0.25 kg，加水約0.5 L，壇口水封。菌種比例為1∶1，同時設置不接種作為對照[15]。按照正交試驗表(見表2)逐一進行試驗，發酵完成后測定pH和乳酸菌菌落數。每個樣品平行測定3次。

表2 最佳發酵條件正交試驗表Table 2 The orthogonal test of optimal fermentation conditions

1.3.7 優化后酸菜成品感官評價

酸菜感官評價：邀請10名食品專業的研究生擔任評審員，各取發酵30 d的樣品25 g，按照感官評定表(見表3)給酸菜成品打分，滿分100分[16]。

表3 酸菜感官評價標準表Table 3 The sensory evaluation criteria of pickles

2 結果與分析

2.1 酸菜發酵菌液pH值變化

在20，25，30 ℃的發酵溫度下，不同菌株引起酸菜發酵液pH值在20 d的變化見圖1。

a.20 ℃時pH值的變化

b.25 ℃時pH值的變化

c.30 ℃時pH值的變化

由圖1可知，20，25，30 ℃發酵時，接入乳酸菌的酸菜均比未接入乳酸菌的酸菜pH值下降快，植物乳桿菌和類干酪乳桿菌發酵酸菜的發酵液pH值變化均較小，比未接入菌株的pH值低，平衡后最終pH值為3.13和3.14。

自然發酵泡菜的發酵過程分為3個發酵階段：初期發酵階段、中期發酵階段和后期發酵階段。自然發酵酸菜在0～5 d時pH值下降較慢，在發酵5～10 d時pH值下降迅速，而在10～20 d時pH值下降非常緩慢，其變化可能是在發酵初期有少量乳酸菌，優勢菌為好氧菌和酵母菌，這兩種菌對乳酸菌的繁殖有抑制作用，從而使pH值變化小；發酵中期，乳酸菌變為優勢菌，pH值下降較快；而當進入末期，乳酸菌繁殖進入穩定期，使pH值下降較慢。人工接種乳酸菌使發酵酸菜沒有初期，直接進入發酵中期，接入乳酸菌發酵減少了發酵初期，使發酵時間縮短，同時產酸抑制其他菌的生長。

2.2 接種量的選擇

不同接種量酸菜發酵液pH值隨發酵時間的變化曲線見圖2。

圖2 不同接種量酸菜發酵液pH值的變化Fig.2 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different inoculation amount

由圖2可知，在5～20 d時不同接種量酸菜發酵液均呈下降趨勢，但在5～10 d時，接種量為8%的發酵液pH值變化較其他接種量更顯著，而在20 d后均趨于平緩。感官分析酸菜顏色透明，菜幫顏色良好，風味純正。

2.3 發酵時間的選擇

圖3 不同發酵時間酸菜發酵液pH值的變化Fig.3 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation time

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，酸菜的pH值逐漸降低，在5～15 d時變化最明顯，呈下降趨勢，在發酵20 d時，pH值達到最低，為3.11，感官分析酸菜顏色透明，菜幫顏色均一，風味純正。20 d后基本持平，當發酵25 d時，pH值為3.12，菜幫顏色變暗；發酵30 d時pH值為3.13，感官分析發酵30 d時酸菜口感過酸，質地變軟，顏色發暗，表明發酵過度。

2.4 鹽水濃度的選擇

不同鹽水濃度酸菜發酵液的pH值隨發酵時間的變化曲線見圖4。

圖4 不同鹽水濃度酸菜發酵液pH值的變化Fig.4 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles with different brine concentrations

由圖4可知，鹽水濃度為4%時，發酵液的pH值下降最顯著，且在20 d時pH值最低，達到了3.13，而鹽水濃度為7%時，pH值在10～25 d時變化緩慢，在發酵30 d時，pH值略微增加，感官分析酸菜顏色變黑，菜葉有腐爛，菜幫沒有脆性。

2.5 發酵溫度的選擇

圖5 不同發酵溫度酸菜發酵液pH值的變化Fig.5 Changes in pH values of fermentation liquid of pickles at different fermentation temperatures

由圖5可知，pH值隨著發酵溫度的變化呈先下降后上升的趨勢，酸菜發酵液在30 ℃發酵過程中pH值下降速度更快，原因在于乳酸菌的最適宜生長溫度為30 ℃。因此，在30 ℃時乳酸菌生長繁殖快，產酸量大。

2.6 正交試驗優化

正交試驗結果用SPSS軟件進行數據分析，極差分析結果見表4和表5，方差分析結果見表6。

2.6.1 不同因素水平下的pH值

不同因素水平下的pH值見表4。

表4 不同因素水平下的pH值Table 4 The pH values at different factors and levels

由表4可知，影響pH值的各因素主次順序為D>A>C>B，即溫度對酸菜pH值的影響最大，而發酵時間的影響最小。最優水平為A2B2C3D2，即以pH值為評價指標，酸菜發酵的最佳發酵條件為：接種量為8%，發酵時間為20 d，鹽水濃度為5%，發酵溫度為30 ℃。由于最優水平不在試驗組中，選取最佳發酵條件進行重復試驗，所得的pH值的平均值為3.04。證明正交試驗條件：接種量8%、發酵時間20 d、鹽水濃度5%、發酵溫度30 ℃為最優水平。

2.6.2 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌數試驗結果

不同因素水平下乳酸菌菌數試驗結果見表5。

表5 不同因素水平下酸菜乳酸菌菌數正交試驗結果Table 5 The orthogonal test results of lactic acid bacteria count of pickles under different factors and levels

由表5可知，影響酸菜乳酸菌菌數的各因素主次順序為D>A>B>C，即發酵溫度對酸菜發酵后乳酸菌菌數的影響最大，而鹽水濃度的影響最小。最優水平為A2B2C1D2，即以乳酸菌菌數作為評價指標，酸菜發酵的最佳發酵條件為：接種量為8%，發酵時間為20 d，鹽水濃度為3%，發酵溫度為30 ℃。由于最優水平不在試驗組中，選取最佳發酵條件進行重復試驗，所得的乳酸菌菌數的平均值為8.3×102CFU/mL。證明正交試驗條件：接種量8%、發酵時間20 d、鹽水濃度3%、發酵溫度30 ℃為最優水平。

表6 正交試驗方差分析結果Table 6 The results of variance analysis of orthogonal experiment

續 表

由表6可知接種量、發酵時間、鹽水濃度、溫度對pH值、乳酸菌菌數測定的影響，發現溫度對pH值和乳酸菌菌數具有顯著影響。

2.6.3 最佳發酵工藝條件的確定

從pH值和乳酸菌菌數這兩個指標綜合考慮，所確定的最佳接種量、最佳發酵時間以及最佳發酵溫度均一致，分別為8%、20 d及30 ℃，而在鹽水濃度上有差異，若以pH值為篩選指標，鹽水濃度為5%；若以乳酸菌菌數為篩選指標，則鹽水濃度為3%。發酵試驗表明，鹽水濃度為3%的酸菜產品比鹽水濃度為5%的口感要好。

因此，綜合考慮pH值、乳酸菌菌數和實際酸菜發酵成品的口感，最終確定選擇最佳發酵條件A2B2C1D2：接種量為8%，發酵時間20 d，鹽水濃度3%，發酵溫度30 ℃。所對應的發酵酸菜的最佳工藝條件：接種量為8%，菜水比為1∶2，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1，菌種培養基為蔬菜培養基，食鹽濃度為3%，30 ℃發酵20 d。

2.7 酸菜成品的感官評價

自然發酵酸菜與接種發酵酸菜評分見表7，對比可以看出，正交試驗接種發酵酸菜的感官評分為88.7，自然發酵酸菜的感官評分為73.1；正交試驗接種發酵酸菜的感官評分高于自然發酵酸菜。自然發酵酸菜有少量發生腐爛，且有難聞的氣味；而優化后發酵酸菜樣品色澤都良好，均優于自然發酵酸菜，這與王旭丹[17]研究直投式酸菜發酵劑發酵酸菜優于自然發酵酸菜的感官品質一致，外觀淺黃色，發酵液澄清微黃。自然發酵酸菜發生腐爛的原因是芥菜中含有少量的乳酸菌，生長繁殖較慢，發酵過程中難免會有腐敗菌產生并且快速繁殖，從而抑制乳酸菌的繁殖。

表7 酸菜樣品感官評價得分Table 7 The sensory evaluation scores of pickle samples

3 結論

從自然發酵酸菜中得到A6植物乳桿菌和A8類干酪乳桿菌兩株乳酸菌，通過單因素試驗和正交試驗，綜合考慮pH值、乳酸菌菌數和實際酸菜發酵成品的口感，得到最佳發酵工藝條件：接種量為8%，發酵時間為20 d，食鹽濃度為3%，發酵溫度為30 ℃，菜水比為1∶2，菌種比例植物乳桿菌∶類干酪乳桿菌為1∶1。在此優化條件下，將優化后的酸菜與自然發酵酸菜進行感官評定，結果發現優化后的酸菜在色澤、香氣、滋味和脆度4個方面均要高于自然發酵酸菜。本研究為大規模工業化生產優質酸菜提供了有益參考。