一株基于高通量測序降解亞硝酸鹽芽孢桿菌的篩選

孫全敏，馬明昊，遲雪梅，遲乃玉，張慶芳*

(1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物 工程技術研究中心，遼寧 大連 116622)

根據研究，攝入過量亞硝酸鹽會降低血液的攜氧能力，引起身體組織缺氧，同時具有一定的致畸性，可以導致發育缺陷[1]。亞硝酸鹽也是營養物污染的一種普遍形式，通常從各種來源排放到水生棲息地，包括氮肥、牲畜糞便、大氣沉積物及污水，使水生棲息地中亞硝酸鹽水平升高，降低水生呼吸物種的血液攜氧能力，從而導致魚類健康受損和大量死亡[2]。在加工肉制品方面，亞硝酸鹽是一種廣泛使用的添加劑，可抑制一些致病微生物和不良微生物(如肉毒梭菌)的生長，同時使肉制品呈現典型的粉紅色，并具有獨特的風味。然而，亞硝酸鹽的使用會導致肉制品中形成致癌物亞硝胺，它還與胃癌、食道癌、鼻咽癌和膀胱癌的風險增加有關。Zhang等[3]研究了2000—2011年我國11320個肉制品樣本中亞硝酸鹽狀態的變化，85%的樣本含有亞硝酸鹽，每年約有20%的樣本亞硝酸鹽含量高于國家標準；結果還表明，肉制品中殘留的亞硝酸鹽總體上沒有得到有效控制，在2000—2011年，食品生產和加工過程中過量使用亞硝酸鹽的潛在問題及其對健康的影響沒有改變，這間接表明亞硝酸鹽中毒的可能性和嚴重的環境污染問題。

目前降解亞硝酸鹽的主要方法有物理法、化學法和微生物降解法等，其中微生物降解法具有更高效、健康、環保等優勢[4]。而傳統篩選目的菌株的一般步驟主要為：(1)從自然環境中采集富含目標菌株的樣本；(2)用特定的培養基富集目標菌株；(3)分離純化；(4)確定分離菌株的性能；(5)通過測序分析確定最有希望的菌株。這個過程耗時，效率低下，而且多僅限于含有目標菌株的環境樣本。同時，即使得到目標菌株，后續提取DNA進行測序等步驟也繁雜、耗時，甚至有時鑒定結果不是自己想要的菌種。因此，需要一種新的篩選策略來提高篩選、鑒定的效率。隨著時代的發展和科技的進步，DNA和RNA測序技術徹底改變了基因組學領域，高通量測序(HTS)是一項廣泛使用并可獲得的技術，它允許科學家以及時和經濟有效的方式對整個轉錄組或基因組進行測序，同時，HTS技術已被證明在鑒定和分離一系列以生物技術為目的的有效菌株方面起著至關重要的作用[5-7]。

根據研究，關于降解亞硝酸鹽的菌株大多數是乳酸桿菌，如郭志華等[8]從泡菜中篩選出6株，忻曉庭等[9]從發酵蔬菜中篩選出72株，肖秋穎等[10]從發酵牦牛乳中篩選出195株。可見乳酸菌是降解亞硝酸鹽的主要菌群，但貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)[11]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[12]、木糖氧化無色桿菌(A.xylosoxidansstrain)[13]等菌株對亞硝酸鹽降解也有良好的效果。同時，優勢菌群的篩選，使得其他能降解亞硝酸鹽的菌株得不到充分挖掘和利用。隨著低成本、高通量測序服務飛速發展，其在微生物菌群篩選及多樣性分析中的應用也越來越廣泛。本研究通過使用16S高通量測序技術，希望能篩選出一株除乳酸菌之外能高效降解亞硝酸鹽的菌株，以期為發掘降解亞硝酸鹽菌群資源及其應用價值開發利用提供一定理論基礎。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗菌種

菌群FXH1：既能降解亞硝酸鹽又能降解硝酸鹽的菌株18個；

菌群BFXH2：能降解亞硝酸鹽但不能降解硝酸鹽的菌株12個。

以上菌種暫由本實驗室保藏，菌株理化性質(亞硝酸鹽降解率、硝酸鹽還原能力、作用環境pH值)本實驗室已測定完成，數據由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

將FXH1、BFXH2兩個菌群樣品進行16S高通量測序，測序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3 菌株分子生物學鑒定確認

將目的菌株活化后通過SDS結合蛋白酶K法[14]提取樣品基因組DNA，用16S rDNA通用引物27F/1492R進行PCR擴增，擴增產物交由寶生物工程(大連)有限公司測序，菌株基因序列在NCBI數據庫中進行比對，確認是否和16S高通量測序結果一致。

2 結果與分析

2.1 16S高通量測序

2.1.1 樣本測序數據質量評估

各樣品測序數據質量評估[15]結果見表1。經拼接、質控和嵌合體過濾后，樣品BFXH2得到62807條序列，有效序列為55257條；樣品FXH1得到61900條序列，有效序列為46800條。

表1 樣品測序結果統計Table 1 Statistics of sample sequencing results

2.1.2 基于OTU的Venn圖分析

通過聚類得到的各樣品的OTU個數見圖1。

圖1 各樣品OTU個數分布圖Fig.1 OTU number distribution diagram of each sample

由圖1可知，樣品BFXH2的OTU數為13，樣品FXH1的OTU數為20。

在97%的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU數，再利用Venn圖[16]進行分析，可進一步找出不同樣品中獨立和共有的菌群數目。

圖2 OTU-Venn圖Fig.2 OTU-Venn diagram

由圖2可知，兩個樣品共有OTU數為9，樣品BFXH2有4個特有的OTU數，樣品FXH1有11個特有的OTU數。

2.1.3 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析可反映單個樣品的物種豐度和物種多樣性，可用于衡量的指標有Chao1和Ace(衡量物種豐度)、Shannon和Simpson(衡量物種多樣性)，但后者受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。在相同物種豐度的情況下，群落多樣性與均勻度呈正相關，當Shannon指數值越大，Simpson指數值越小時，表明樣品的物種多樣性越高[17]。在97%的相似度水平下，結果分析見表2。

表2 Alpha多樣性指數分析Table 2 Alpha diversity index analysis

由表2可知，FXH1的物種豐度大于BFXH2，且物種多樣性更高。

2.1.4 物種分類水平分析

2.1.4.1 門等級分類

圖3 門等級物種分布圖Fig.3 Species distribution diagram at phylum level

由圖3可知，在門等級上，BFXH2包括3個門，其中厚壁菌門所占相對豐度為56.4%，變形菌門占42.6%，放線菌門占0.9%。FXH1包括3個門，其中變形菌門所占相對豐度為70.9%，厚壁菌門占28.1%，放線菌門占1%。

2.1.4.2 屬等級分類

圖4 屬等級物種分布Fig.4 Species distribution diagram at genus level

由圖4可知，在屬等級上，BFXH2包括8個屬，其中芽孢桿菌屬所占相對豐度為56.4%，假單胞菌屬占10.3%，不動桿菌屬占9.6%，克雷伯菌屬占4%，泛菌屬占0.06%，谷氨酸桿菌屬占0.9%，其他占0.6%，未分類占18.1%。FXH1包括10個屬，其中乳球菌屬所占相對豐度為27.9%，假單胞菌屬占26.9%，假交替單胞菌屬占21.9%，泛菌屬占2.0%，不動桿菌屬占1.1%，紅球菌屬占1.0%，寡養單胞菌屬占0.6%，克雷伯菌屬占0.4%，其他占0.8%，未分類占17.5%。

2.1.5 16S功能基因預測分析

2.1.5.1 KEGG功能預測分析

圖5 BFXH2與FXH1樣品KEGG功能預測對比圖Fig.5 Comparison of KEGG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

由圖5可知，由KEGG功能預測對比可看出兩個樣品在代謝、遺傳信息處理和環境信息處理的豐度方面有較多的顯著性差異。其中樣品FXH1在代謝功能中的外源生物的生物降解和代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、全面和該書圖譜等和在細胞過程功能中的細胞運動、細胞生長和死亡、運輸和分解代謝等以及在遺傳信息處理功能中的轉錄、復制和修復、翻譯上相對豐度顯著大于樣品BFXH2；而樣品BFXH2在碳水化合物代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝和在環境信息處理功能中的信號轉導、膜轉運上相對豐度顯著大于樣品FXH1。

2.1.5.2 COG功能預測

由圖6可知，由COG功能預測對比可看出兩個樣品在細胞過程與傳遞、信息存儲與處理和代謝等方面的豐度有較多的顯著性差異。其中樣品FXH1在細胞過程與信號傳遞功能中的信號轉導機制、細胞壁/膜/包膜生物發生、細胞內運輸、分泌和囊泡運輸、細胞運動性等和在代謝功能中的核苷酸轉運和代謝、脂類的運輸和代謝等以及在信息存儲與處理功能中的翻譯、核糖體結構和生物發生、復制、重組和修復、RNA加工和修飾上相對豐度顯著大于樣品BFXH2；樣品BFXH2在代謝功能中的能源生產和轉換、氨基酸的運輸和代謝、碳水化合物的運輸和代謝、次生代謝產物的生物合成、運輸和分解代謝和在信息存儲與處理功能中的轉錄以及在細胞過程與信號傳遞功能中的細胞外結構、防御機制上相對豐度顯著大于樣品FXH1。

2.2 菌株分子生物學鑒定確認

因樣品BFXH2中芽孢桿菌屬所占豐度較大，且芽孢桿菌屬應用前景良好，因此從中選出菌株“8”進行分子生物學鑒定。對菌株“8”進行NCBI的16S rDNA 基因序列比對分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，結果顯示與16S高通量測序結果對應。

圖6 BFXH2與FXH1樣品COG功能預測對比圖Fig.6 Comparison of COG function prediction of BFXH2 and FXH1 samples

3 討論與結論

高通量測序技術因測序數量龐大、涵蓋面廣、檢測快速準確等優點，已被廣泛應用，如在發酵食品微生物多樣性的研究[18]、泡菜中常見食源性致病菌風險分析[19]及對酸漿水中的微生物組成情況分析[20]等方面。而本文通過高通量測序技術對能降解亞硝酸鹽的FXH1、BFXH2兩個樣品進行物種豐度、物種多樣性、不同分類水平分析，并進一步進行了功能基因的預測。最后根據微生物組成與結構分析，在屬等級上，BFXH2中芽孢桿菌屬所占豐度最大，為56.4%，從中挑選編號為“8”的菌株進行鑒定，經鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，此菌對亞硝酸鹽的降解率為99.7%，作用環境pH為3.98。根據研究發現芽孢桿菌應用廣泛，如可用在醬腌菜中，降低泡菜中亞硝酸鹽和生物胺等有害物質[21]，作為淡豆豉炮制過程中對黃曲霉毒素的抑制菌[22]，在醬香大曲中作為產醬香菌[23]等方面，同時Hong等[24]的研究結果表明可將B.subtilis和B.indicus菌株用作食品補充劑，由此可預見菌株“8”具有良好的應用潛能，特別是在降解亞硝酸鹽方面可發揮很大的作用。該種篩選策略不僅可以大大提高對菌種資源的利用，降低篩選成本和時間，大大提高選菌及鑒定的效率，同時還可進一步了解其應用前景，為相應菌株的進一步應用提供一定的借鑒。