一株芘降解菌的分離鑒定及其特性初步研究

張天宇 王美琴 劉龍祥 任麗麗 馬燕陽 翟振龍 樊平 吳濤

摘 要：以黃河三角洲重鹽堿地原油污染區健康生長的鹽生植物蘆葦、稗草、鹽地堿蓬為材料，采用芘為碳源，分離篩選具有芘降解功能的植物內生細菌，并研究其促進植物生長的特性。結果表明，篩選得到7株植物內生細菌具有溶解有機磷能力，7株菌7d對多環芳烴芘的降解率為59%～78%，其中菌株LDD3的降解效果較為顯著，降解率達到78%。經分子鑒定，菌株LDD3為施氏假單胞菌，在WB培養基和芘培養基中對數生長期分別為4～16h、24h～48h，最適生長鹽度范圍為1%～3%。

關鍵詞：植物內生細菌;芘;降解;施氏假單胞菌

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0029-04

Isolation， Identification and Characterization of a Pyrene Degrading Strain

ZHANG Tianyu1? ?WANG Meiqin1? ?LIU Longxiang1? ?REN Lili1? ?MA Yanyang1? ?ZHAI Zhenlong1

FAN Ping2? ?WU Tao1，3

（1Shandong Provincial Engineering and Technology Research Center for Wild Plant Resources Development and Application of Yellow River Delta， College of Biological and Environmental Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， China; 2Binzhou Agriculture and Rural Bureau， Binzhou 256601， China; 3Shandong Provincial Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta， Binzhou University， Binzhou 256600， China）

Abstract： Using the healthy halophytes Phragmites australis， Echinochloa crusgalli and Suaeda salsa growing in the heavy saline alkali soil oil polluted area of the Yellow River Delta as materials and pyrene as carbon source， the plant endophytic bacteria with pyrene degradation function were isolated and screened， and their plant growth promoting characteristics were studied. The results showed that the seven strains of plant endophytic bacteria had the ability to dissolve organic phosphorus. The degradation rate of polycyclic aromatic pyrene was 59%～78% in 7 days， and the degradation rate of strain LDD3 was 78%. By molecular identification， strain LDD3 was Pseudomonas schneider. The logarithmic growth periods of LDD3 in WB medium and pyrene medium were 4～16h and 24h～48h respectively. The optimum growth salinity range of strain LDD3 is 1%～3%.

Key words： Plant endophytic bacteria; Pyrene; Degradation; Pseudomonas schneider

多環芳烴（PAHs）是一類常見的具有“三致效應”的有機污染物，主要來源于化石燃料燃燒、生活垃圾焚燒以及化工行業排放的廢棄物等，容易在土壤中累積，同時能夠通過地球化學循環進入大氣、水體，造成二次污染[1]。PAHs具有較強的穩定性、脂溶性和累積性，極易被動物腸胃吸收，并通過食物鏈放大而富集[2]。因此，控制和治理PAHs污染是當前面臨的重要的環境問題之一。當前，PAHs污染土壤治理方法主要有物理、化學、生物修復，其中生物修復相比于物理、化學修復，具有經濟簡便、環境友好及無二次污染的優點，是修復環境中PAHs污染最具前景的方法，能夠降解PAHs污染物特性植物內生細菌的發現，為植物修復PAHs污染帶來了新的研究方向。目前，研究人員已從植物中篩選出若干種可促進植物代謝體內PAHs污染物的功能內生細菌，這些研究主要集中在萘、菲等低分子量PAHs污染物。芘是由4個苯環對稱排列組成的PAHs，作為高分子量PAHs，其在環境中穩定存在[3]。目前，篩選分離降解芘等高分子量多環芳烴的植物內生細菌研究還少有報道。

本研究以黃河三角洲重鹽堿原油污染地區健康生長的鹽生植物（稗草、鹽地堿蓬、蘆葦）為材料，采用芘為PAHs代表物，分離篩選出具有芘降解功能的植物內生細菌，利用分子生物學技術對其鑒定，并研究其促生和耐鹽特性，為PAHs污染土壤的生物修復提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 植物樣品采自黃河三角洲地區油井旁鹽漬化土壤上健康生長的蘆葦、稗草、鹽地堿蓬。

1.2 培養基 SL-6（g/L）：ZnSO4·7H2O 0.10，MnCl2·4H2O 0.03，H3BO3 0.30，CoCl2·6H2O 0.20，CuCl2·2H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na2WO4·2H2O 0.03，pH為7.8±0.2。

SL-4（g/L）：FeSO4·7H2O 0.002，10%微量元素溶液SL-6。

無機鹽培養基（g/L）：Na2HPO4·12H2O 17.90，NaH2PO4·2H2O 7.80，（NH4）2SO4 5.00，KCl 5.00，1%微量元素溶液SL-4。

WB培養基：LB培養基與無機鹽培養基進行1∶1比例混合制備而成。

蒙金娜有機磷培養基配方參照文獻[4]方法。

PKO無機磷培養基配方參照文獻[4]方法。

1.3 芘降解菌的分離 新鮮植物樣品用自來水沖洗35min，再用無菌水沖洗4次，每次沖洗時間4min。用滅菌濾紙吸干植物表面水分，用無菌剪刀將植物分為地上部和地下部，分別用70%酒精浸泡2min，無菌水清洗4次，3%NaClO浸泡2次，每次浸泡時間為1min，再用無菌水清洗4次，每次3min。經以上處理完的樣品放在LB固體培養基上，培養24小時之后，檢測表面是否滅菌完全[5]。將上述樣品分別稱量5g，加入10倍體積PBS溶液，研磨，吸取5mL上清液轉到50mL濃度為50mg/L的芘培養基中，25℃，180r·min-1培養3d，轉接5次，梯度稀釋，涂布，25℃恒溫培養。待長出單菌落后純化3次，得到功能菌株[6]。

1.4 高效芘降解菌株的篩選 將分離純化得到的菌株接種于含芘液體培養基，設置3個對照，每株菌設3次重復。28℃、160r/min條年下振蕩培養7d，測定培養基中芘濃度。培養基中芘濃度測定方法：將含芘無機鹽培養基轉入100mL離心管，加等體積正己烷，渦旋振蕩1min，靜置，取有機相用0.22μm有機濾膜過濾，硅膠柱純化，用高效液相色譜儀測定芘含量。高效液相色譜條件：C18反相色譜柱，流動相V（甲醇）∶V（超純水）=80∶20，流速1.0mL/min，柱溫30℃，檢測波長254nm，進樣量20μL，時間12min。

1.5 菌種鑒定 菌種分子鑒定由中美泰和公司進行，利用鄰接法在MEGA.7軟件上構建系統發育樹。

1.6 菌株溶磷特性試驗 分別以Ca3（PO4）2、卵磷脂代表無機磷和有機磷。采用點接法接種于有機磷和無機磷固體培養基上，在恒溫培養，觀察是否產生溶磷透明圈。

1.7 生長及耐鹽特性 生長曲線測定：準確吸取10mL細菌過夜培養液（培養10～12h），按照5%接種量接種到190mLWB培養基或者，28℃、160r/min培養，每隔2h取樣，在600nm下測定吸光度。設置無菌組作為對照，每株菌設置3個重復。菌株在芘培養基條件下的生長曲線操作步驟同WB培養基，取樣時間每隔為12h。耐鹽特性：吸取1mL對數期的菌懸液分別接種到NaCl濃度為1%、3%、5%、7%、9%、11%的10mLWB培養基中，設置3個重復。在160r/min、28℃條件下振蕩培養至對數期，600nm測其吸光度。

2 結果與分析

2.1 分離篩選的芘降解菌 通過選擇性富集培養，從黃河三角洲鹽漬化石油污染區健康植物體內分離篩選出7株具有芘降解功能的植物內生細菌，編號分別為LDD3、YDB1、LDB7、YUA6、LDB11、LUD5、LDC7。通過搖瓶培養，測定菌株降解芘能力，各株菌降解對芘的降解率如圖1所示。由圖1可知，7株菌對芘的降解率均達到55%以上，其中LDD3對芘的降解率最高，達到78%。因此，選擇菌株LDD3作進一步研究。

2.2 芘降解菌株溶磷能力 將高效降解菌LDD3分別點接于無機磷和有機磷培養基平板上，培養7d后，菌株在有機磷培養基上產生溶磷透明圈，在無機磷培養基上未產生溶磷圈，說明菌株LDD3具有溶解有機磷的能力。

2.3 芘降解菌株所屬菌種鑒定 菌株LDD3經16S rDNA基因測序，得到堿基序列，在GenBank數據庫中比對，菌株LDD3與已報道的多株假單胞菌屬（Pseudomonas）同源性達到99%以上，與施氏假單胞菌同源性達到100%，確定其為施氏假單胞菌，利用鄰接法通過MEGA.7軟件構建系統發育樹，結果如圖2所示。

2.4 生長及耐鹽特性 LDD3在WB培養基和芘培養基中的生長曲線結果如圖3所示。由圖3可知，菌株LDD3在WB培養基條件下0～4h內生長緩慢，4～16h生長較快，16h后達到穩定生長期。在芘培養基中24～36h達到對數生長期，36～48h生長穩定，84h后菌株開始衰亡。

不同NaCl濃度下菌株LDD3生長情況如圖4所示。由圖4可知，隨NaCl濃度的增加，LDD3的生長呈下降趨勢。在1%、3%NaCl濃度下生長的最好，5%NaCl濃度抑制菌株的生長，表明菌株LDD3最適生長鹽度范圍為1%～3%。

3 討論

PAHs微生物降解一直是國內外研究的熱點，而微生物具有生長周期短、易于馴化培養、種類豐富等優點，其在PAHs的生物修復、轉化及清除中具有良好的應用前景。因此，篩選高效降解菌是修復PAHs污染環境的關鍵環節[7]。本研究通過選擇性富集培養法篩選7株具有芘降解功能的植物內生細菌，在芘培養基中搖床培養及高效液相色譜儀測定，復篩得到高效降解芘的植物內生菌LDD3，通過16S rDNA基因測序比對分析LDD3為施氏假單胞菌（Pseudomonas Schneider）。

LDD3具有溶解有機磷的能力，最適生長鹽度范圍為1%～3%，7d對芘降解率達到78%。王靜[8]等從天津港石油污染區篩選的B5具有良好的芘降解性能，在培養36h對芘（150mg/L）的總降解率高達96.3%。馮清敏[9]等篩選的Pseudomonas sp.M4，以原油為共代謝基質時芘的降解率最高，30d降解率達61.23%。徐虹[10]等篩選的10號菌株在在混合反應體系中培養30d后芘的降解率為80%，在只含一種PAH的單反應體系中該菌對芘的降解能力則降低，降解率僅為62.47%。與混合PAHs培養體系相比，在單一PAHs培養體系中，細菌的對數生長期縮短1/3。環境中的PAHs多以混合物的形式存在，此前的研究發現，在生長培養基中添加額外的碳源可以提高細菌對芳香族化合物的降解效率[11]。共代謝是自然環境中重要的代謝機制[12]。大多數微生物無法利用多環芳烴作為唯一的碳源，但在其他低分子量營養物的存在下表現出降解能力[12]。共代謝作用是微生物降解多環芳烴的重要手段，馮清敏等[9]進行了共代謝實驗，結果表明，相較于飽和烴和芳烴，以原油為共代謝基質可增強其所篩選菌株M4對芘的共代謝作用。本研究采取芘作為唯一碳源培養基，未涉及其共代謝作用機制研究，下一步將研究多種PAH為碳源條件下LDD3的降解特性。

4 結論

從黃河三角洲重鹽堿原油污染地區健康生長的、蘆葦、稗草、鹽地堿蓬內分離篩選出具有芘降解功能的植物內生細菌7株，篩選得到的7株降解芘的植物內生菌都具有溶解有機磷的能力。通過高效液相色譜儀測定菌株LDD3降解芘能力較強，7d對芘降解率達到78%。經16S rDNA基因分子鑒定，LDD3為施氏假單胞菌。LDD3在WB培養基和芘培養基中的生長曲線，對數生長期為4～16h，耐鹽度范圍為1%～3%。通過對該菌促生和耐鹽特性的初步研究，為PAHs污染土壤的生物修復提供技術支撐。

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基金項目：山東省重點研發計劃（2019GSF109036）;國家自然科學基金項目（41977124）;山東省高等學校青創科技支持計劃（2020KJD005）;山東省大學生創新創業訓練計劃項目（S201910449067）。

作者簡介：張天宇（2001—），女，山東德州人，本科，研究方向：污染土壤生物修復。

通訊作者：吳濤（1980—），男，山東濟南人，博士，教授，研究方向：有機污染土壤修復。? 收稿日期：2021-12-21