典型藏茵陳原植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）分子水平的研究進展

董志強 杜少波 陳曉文 謝惠春

摘 要：藏茵陳是藏族藥物歷史悠久的八珍藏藥之一，具有清熱、解毒、清肝利膽的功效。藏茵陳分為獐牙菜屬、花錨屬、扁蕾屬等，其中川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾分別為其屬中最具有代表性的植物，藥效佳，受到了越來越多的歡迎。近年來，藥用植物在分子水平生物合成機制與調控、分子標記技術、次生代謝產物生物合成途徑（基于轉錄組測序技術）等方面的研究已然成為現如今分子水平研究中最活躍、最熱點的領域。該文通過查閱近年文獻，從生物合成分子機制與調控、分子標記技術、次生代謝產物生物合成途徑（基于轉錄組測序技術）等方面對3種典型藏茵陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）的研究進展進行了綜述與展望，為其今后在分子水平上相關機制的研究提供參考。

關鍵詞：獐牙菜;川西獐芽菜;橢圓葉花錨;濕生扁蕾;分子調控機制

中圖分類號 R282 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2022）11-0013-04

Research Progress on Molecular Level of Typical Original Plants of Tibetan Wormwood（Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa）

DONG Zhiqiang? ?DU Shaobo? ?CHEN Xiaowen? ?XIE Huichun

（Key Laboratory of Medicinal Plant and Animal Resources of Qinghai-Tibet Plateau in Qinghai Province， Qinghai Normal Unversity， Xining 810008， China）

Abstract： Tibetan Herba Artemisiae Scopariae is one of the eight Tibetan medicines with a long history of Tibetan medicine， which has the effects of clearing away heat， detoxifying， clearing away liver and benefiting gallbladder. Tibetan Artemisia can be divided into Swertia， Anthurium and Flaveria， among which Swertia in western Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa are the most representative plants with the best efficacy， which have gained more and more popularity. In recent years， the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis in medicinal plants， molecular marker technology and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology） have become the most active and hot fields in molecular level research. In this paper， the research progress of three typical Tibetan Artemisia plants （Swertia mussotii， Halenia elliptica D. and Gentianopsis paludosa） was summarized and prospected from three aspects， such as the research on molecular mechanism and regulation of biosynthesis， molecular marker technology， and biosynthetic pathway of secondary metabolites （based on transcriptome sequencing technology）， so as to provide reference basis for the related mechanism research at molecular level in the future.

Key words： Swertia; Swertia mussotii; Halenia elliptica D.; Gentianopsis paludosa; Molecular regulation mechanism

藏茵陳，藏藥名“桑蒂”“蒂達”，始載于藏醫藥書《四部醫典》，具有清熱解毒、清肝利膽的功效，在歷代的藏醫藥著作如《晶珠本草》《鮮明注釋》等均有記載[1]。廣義的藏茵陳主要包括獐牙菜屬Sweriat、花錨屬Halellia、扁蕾屬Gentianopsis等[2]。其中，川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾是其各自屬屬中最具有代表性的植物，是藏茵陳入藥原植物中的主要植物，有關它們的化學成分組成、藥理作用方面的研究文獻報道數不勝數[3]。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾均以全草入藥，味苦、性寒，均具有清熱利濕、平肝利膽作用，均是藏醫臨床治療肝膽疾病的常用藥物[4]。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾的主要化學成分均為呫噸酮及其苷、裂環烯醚萜類、三萜類及黃酮苷等化合物，另外還含有齊墩果酸等，具有保肝、抗氧化、抗病毒、抗炎性反應、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗纖維化等作用[5]。由于近年來傳統藏藥被認為對治療相關疾病具有較好的療效，傳統藏藥的開發與利用具有巨大的上升空間，對其的研究與發展也受到了社會各界的廣泛關注[6]。

近年來，藥用植物在分子水平上的研究成日益增多，尤其對于驗證和探討發現藥用植物相關生物合成途徑以及相關次生代謝產物合成途徑中的關鍵酶、關鍵基因、關鍵蛋白等，通過對其分子調控機制的研究可以有效地揭示藥用植物中內源合成機制以及調控系統，真正探討出關鍵化合物合成的機制與其必要的途徑，為合成重要的化合物提供基礎[7]。其中，轉錄組測序技術已成功應用于動物、植物、微生物等各類生物當中，主要涉及疾病研究、關鍵基因發掘及基因剪切等方面[8]，以及利用pcr、western bolt等技術[9]驗證相關通路的分子機制研究成為目前對藥用植物藥效分析及生物合成的分子機制的研究熱點，具有較大的發展潛力。對其挖掘功能基因、探究藥用植物有效成分生物合成的分子機制、開發新的藥用植物資源及分子輔助育種技術等都具有重要的意義[10]。本文通過查閱近年文獻，分別對3種藏茵陳入藥原植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）從生物合成分子機制與調控研究、分子標記技術研究、次生代謝產物生物合成途徑（基于轉錄組測序技術）3個方面的研究進展進行系統梳理，為今后藏茵陳原植物的研究提供參考。

1 生物合成分子機制與調控

生物合成機制調控中活性成分在藥用植物中具有重要作用，其生物合成途徑解析的挖掘也已成為藥用植物研究的主要目標之一。川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾的活性成分中的（口山）酮類、三萜類、環烯醚萜類、黃酮類[11]均被公認為對治療肝病、炎癥、腫瘤、癌癥等有著明顯的療效。目前，關于生物合成的通路及關鍵酶及關鍵基因等調控機制大多數源于上述幾種活性成分。

杜曉煌[12]等用川西獐芽菜醇提活性物質來驗證肝細胞膽汁酸轉運蛋白Mrp4（multidrug resistance-associated protein4，Mrp4）、轉錄因子Nrf2的調控作用，通過RT-qPCR、Western blot檢測大鼠肝臟細胞膜轉運蛋白Mrp4、Mrp3及相關核受體在mRNA和蛋白水平的表達變化，均發現Mrp4、Mrp3、Nrf2的表達均增高，表示這種調控作用可能與Nrf2相關。Wu J[13]等通過對川西獐芽菜中環烯醚萜類中的獐芽菜苦苷成分進行提取，驗證其對缺氧-葡萄糖剝奪/復氧（OGDR）刺激的人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞的潛在神經保護作用，通過Western blot方法對TLR4相關蛋白進行測定，發現提取物可以降低TLR4、MYD88、NF-KBp65和PARP1的表達，說明獐芽菜苦苷可以通過TLR4/PARP1/NF-KB途徑減輕ROS水平升高和抑制凋亡，從而保護SH-SY5Y細胞免受OGDR誘導的損傷。譚湘姍[14]等利用橢圓葉花錨化學成分中的1-羥基-2，3，5-三甲氧基（口山）酮（HM-1），探索其在大鼠肝臟微粒中的代謝途徑，通過采用大鼠肝臟微粒體溫孵體系，結合高效液相-離子阱-飛行時間質譜技術（LC/MSn-IT-TOF），對其產生的6個代謝產物通過肝藥酶細胞色素P450篩選的5個主要的CYP450酶亞型，即CYP1A2，2C9，2D6，2E1和3A4在HM-1中進行抑制率情況進行統計，發現5個CYP450酶亞型均介導了HM-1在大鼠肝臟微粒體中的代謝，其中CYP2C6/11與CYP3A2最為明顯，推測其可能是參與HM-1在大鼠肝臟微粒體代謝的主要CYP450酶。王昕[15]等通過對橢圓葉花錨的總黃酮進行提取，構造肝纖維化大鼠模型肝星狀細胞（HSC），由于α-肌動蛋白（α-SMA）的高表達可以增強HSC的活化，造成肝纖維化及肝硬化，研究發現，橢圓葉花錨總黃酮提取物可以降低HSC激活標志物α-肌動蛋白（α-SMA）的表達，造成HSC凋亡，這可能是抗肝纖維化的一條有效途徑。趙慧巧[16]等通過用濕生扁蕾的提取物來探討NF-KB信號通路誘導結腸癌SW480細胞凋亡的作用及其機制，利用Hoechst染色以及檢測NF-KB蛋白的表達量發現一定濃度的濕生扁蕾提取物經過處理后，在SW480細胞中，NF-KB的表達明顯下調，表明濕生扁蕾可能通過NF-KB信號通路來介導的腫瘤機制，造成腫瘤細胞凋亡。

2 SSR分子標記技術

SSR分子標記技術[17]在藥用植物基因組中散布著大量的串聯重復序列，具有多態性高、重復性好、共顯性、覆蓋面廣、易檢測、操作簡單等優點，已經在遺傳圖譜構建、基因定位和分子標記輔助育種、遺傳多樣性分析和品種及純度鑒定等方面得到了廣泛應用。SSR分子標記技術作為高通量測序技術提供前導性研究，也為驗證相關次生代謝產物的關鍵基因以及相關通路做鋪墊，起到了至關重要的作用[18]。

劉越[19]等利用MISA（MicroSAtelite）軟件對川西獐牙菜轉錄組序列68787條跨疊群（contigs）進行簡單重復序列（SSR）位點的挖掘，發現5099條序列中含有5610個SSR位點，其中三核苷酸重復基源最高，其次為二核苷酸，SSR主要以5～10次重復為主，長度集中在12～30bp，結果發現川西獐牙菜轉錄組SSR的出現頻率高，重復類型豐富，表明川西獐芽菜SSR具有較高的可用性。Zhang[20]等利用磁珠富集法（FIASCO）開發了12個橢圓葉花錨的多態性微衛星DNA（microsatellite DNA，亦稱SSR），這些引物在備檢的一個異型花個體上也表現出通用性。Yang等利用NGS Illumina技術得到橢圓葉花錨的轉錄組，其中32109單基因成催化功被掃描，形成了簡單重復序列（SSRs），并對其進行注釋，發現其在細胞成分組成、催化活性因子、結合因子以及細胞代謝過程中表現最為豐富。此外，還通過設計SSR引物進行PCR擴增，鑒定其在8個種群40個個體樣本中的多態性差異，發現橢圓葉花錨親緣關系與地理距離之間存在顯著性差異，具有系統的地理結構，還證明了橢圓葉花錨與滇黃芩具有親緣性關系，存在跨物種轉移的能力，為研究橢圓葉花錨與其近緣性物種的遺傳多樣性和種群歷史提供了有價值的資料。王久利[21]等利用SR search軟件檢測橢圓葉花錨得到5種類型的SSR（二、三、四、五、六核苷酸）位點共6201個，并成功設計其中3865個SSR引物，從中挑選出65對可對應的引物。通過橢圓葉花錨的4個居群32個個體進行pcr和聚丙烯酰氨凝膠電泳驗證后，發現其中14對引物能在絕大多數個體中擴增，且13對具多態性，從而得到了橢圓葉花錨近緣類群的一個值得參考的數據庫。

3 次生代謝產物生物合成途徑（基于轉錄組測序技術）

次生代謝產物[22]是藥用植物的重要組成部分，其種類繁多，主要包括含氮有機物、生物堿、萜類、酚類、黃酮類及有機酸等。藥用植物具有作用靶點多，組分復雜的特點，通過轉錄組測序解析次生代謝產物生物合成途徑并挖掘關鍵酶基因，可為藥用植物活性成分的積累和高效利用提供科學依據。

李曉雪[23]等利用川西獐芽菜葉片cDNA為模板，進行pcr擴增，得到特異性片段，并將特異性片段與Peasy-Blunt Simple Clonging Vector連接，進行高通量測序，通過序列對比及生物統計學方法分析驗證了7-脫氧馬錢子酸羥化酶（SmDL7H）被成功克隆，7-脫氧馬錢子酸羥化酶（SmDL7H）是川西獐牙菜裂環烯醚萜合成途徑中關鍵酶，它的成功克隆為研究裂環烯醚萜類化合物合成途徑奠定基礎。Li WJ[24]等通過川西獐芽菜轉錄組數據，克隆DXS2基因（基因庫編號MH535905），命名為SmDXS2。因為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶2（DXS2）是MEP途徑的第一個關鍵酶，在植物萜類生物合成中起到重要作用，實驗結果顯示，克隆的SmDXS2蛋白與龍膽DXS2蛋白同源，與預期大小一致，為研究環烯醚萜類化合物合成及代謝通路做鋪墊。Liu Y[25]等通過高通量技術對川西獐芽菜根、莖、葉、花的轉錄組進行測序，進行GO和KEGG在內的注釋數據庫的BLAST搜索，通過qRT-PCR驗證了39個編碼環烯醚萜生物合成關鍵酶的候選轉錄本在不同組織中的表達譜，發現在川西獐芽菜不同部位的基因存在較大的表達差異性，其中7DLGT基因的表達水平與其他基因顯著不同，它的低表達可能說明其是在裂環烯醚萜代謝途徑中的限速酶，SLS基因與川西獐芽菜中的2個同源SLS基因表達模式不同，但是否具有功能差異還不得而知，為進一步挖掘調控藥用成分次生代謝產物合成的關鍵酶基因奠定基礎。

4 結論與展望

本文從生物合成分子機制與調控、分子標記技術、次生代謝產物生物合成途徑（基于轉錄組測序技術）等方面梳理了國內外近年來在3種上的典型藏茵陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）研究成果。結果顯示，生物合成分子機制與調控有助于得到新的功能基因和代謝通路，為天然藥物來源新途徑，種質資源鑒定、保存、擴大與優良種質選育提供分子基礎。SSR分子標記的開發，通過構建藥用植物指紋圖譜，為分子標記輔助育種，種質資源收集、鑒定與評價提供技術支撐。次生代謝產物生物合成途徑可以通過轉錄組測序技術了解其次生代謝產物的生物合成途徑的分子機制及其合成所需的關鍵酶基因，為進一步研究次生代謝調控奠定了基礎，推動了藥用植物次生代謝工程的發展。但也存在不足之處，其中川西獐芽菜在分子水平上的相關研究進展均超過了橢圓葉花錨及濕生扁蕾，這可能與川西獐芽菜被廣泛認為是藏茵陳的正品有關。但隨著野生資源被破壞嚴重，無法得到有效保護，導致其瀕臨滅絕，而通過對其基源性植物的開發與探索，也能取得不錯的成果，解決燃眉之急。其中，橢圓葉花錨在轉錄組測序方面也只有相關分子標記的研究，而濕生扁蕾更甚，在轉錄組測序方面上幾乎沒有文獻報道，但其在治療結腸癌方面有著顯著療效，這些都說明3種典型藏因陳植物（川西獐芽菜、橢圓葉花錨、濕生扁蕾）在分子水平的研究都具有局限性，應當在其后的研究中多多探討，尤其是在轉錄組測序方面，可以通過測序藥用植物不同部位、不同地點、不同海拔等系列條件，尋找差異表達基因，從而進一步確定驗證相關生物合成以及次生代謝物的關鍵基因、關鍵蛋白等，結合新興的蛋白質組學、代謝組學研究，實現高通量與高效率的結合，助力傳統中藏藥的現代化進程。

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基金項目：科技部“第二次青藏高原綜合科學考察研究”生命地球化學循環與環境健康專題（2019QZKK0606）;青海省重大科技專項青海生態環境價值評估及大生態產業發展綜合研究（2019-SF-A12）;青海省科技廳青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室（2020-YJ-Y40）;基于道地演變的5種多基源中藏藥材品質評價及轉錄組研究（2017-ZJ-774）;中國科學院2018年度“西部之光”人才培養引進項目（人字[2018]99號）。

作者簡介：董志強（1996—），男，河南三門峽人，碩士研究生，研究方向：生態學。

通訊作者：謝惠春，男，博士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：青藏高原動植物資源。? 收稿日期：2021-12-21