非小細胞肺癌不同樣本中EGFR 基因突變、PD-L1表達檢測的一致性

師藝，馬文梅，劉婷，張巍

新疆醫科大學第一附屬醫院病理科，烏魯木齊 830000

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤［1］，85%以上的肺癌為非小細胞肺癌（NSCLC），其中有2/3 的肺癌患者確診時已是晚期，失去最佳手術時機，且放化療效果不佳，5 年生存率僅為15%左右［2］。近年來，隨著精準醫療的出現，靶向治療如靶向表皮生長因子受體（EGFR）的酪氨酸激酶抑制劑（TKI）、免疫治療如免疫檢查點抑制劑的臨床應用極大的改善了晚期NSCLC 患者的預后［3］。但使用EGFR-TKI 或者免疫檢查點抑制劑的前提條件是檢測EGFR 基因突變類型或者程序性死亡配體1（PD-L1）表達水平。腫瘤組織檢測是肺癌診斷的金標準，但晚期患者難以獲得實體腫瘤組織，而穿刺樣本存在一定局限性，如采樣錯誤或腫瘤細胞含量低。此外，臨床需要重復采樣來監測治療效果或與耐藥性相關的變化從而調整藥物，但重復組織采樣對患者來說難以承受［4］。因此，對于非侵入性的體液標本的需求日益增多，尤其對于無法進行活檢或無法獲得足夠組織的患者，體液標本是唯一可用于基因檢測的樣本類型。胸腔積液和血液是除腫瘤組織外可用于EGFR 基因突變檢測的樣本［5］，另外也有研究表明NSCLC 患者胸腔積液標本可以檢測PD-L1 的表達［6］。因此，本研究通過檢測NSCLC 患者腫瘤組織、血液、胸腔積液中EGFR 的突變情況，以及腫瘤組織、胸腔積液細胞中PD-L1的表達，分析不同樣本類型檢測結果的一致性和差異性，為指導NSCLC患者精準靶向治療和免疫治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年6 月—2021 年6 月于本院就診的NSCLC 患者150 例，其中男88 例，女62例；年齡27~90 歲，中位年齡62 歲。納入標準：病理檢查診斷為肺腺癌；同時滿足有腫瘤組織、胸腔積液及血液樣本；腫瘤組織、胸腔積液和血液樣本同一天獲取。患者知情同意，本研究經過醫院醫學倫理委員會批準（220610-02）。

1.2 胸腔積液細胞蠟塊制備 胸腔積液樣本靜置后，取底部樣本20 mL，2 000 r/min 離心5~10 min，半徑為12.4 cm，吸干上清液。加入4%中性緩沖甲醛液混勻，2 000 r/min 離心5 min，半徑為12.4 cm，吸干上清液，輕輕沿管壁加入95%乙醇，靜置1~2 h，用尖頭的硬簽將沉淀物挑出，放入包埋盒，經過固定、脫水，石蠟包埋成細胞蠟塊。

1.3 腫瘤石蠟組織、胸腔積液細胞蠟塊及血漿游離DNA 提取 腫瘤石蠟組織和胸腔積液細胞蠟塊（腫瘤組織所占切片率＞30%）中切取4~5 μm 厚的切片，切片依次放入二甲苯缸中進行脫蠟，然后依次放入無水乙醇缸中洗脫二甲苯，水沖洗切片，用一次性刀片將腫瘤組織刮入1.5 mL EP 管中，按照QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒（德國Qiagen公司）說明書提取DNA，加入Buffer DTL、Protease K Solution，于56 ℃消化1 h，加入Buffer DES，于90 ℃孵育1 h。液體轉移到DNA 吸附柱中離心后，加入Buffer DTE 靜置離心，收集DNA。血漿游離DNA 按照QIAamp? MinElute?ccfDNA Midi Kit 試 劑 盒（Qiagen 公司，德國）說明書提取血液樣本DNA，將磁珠懸浮液、蛋白酶K、磁珠結合溶液與患者血漿混合，室溫孵育10 min，置于磁力架上吸附至溶液透明，棄去上清，加入200 μL 洗脫溶液，振蕩混勻后，置于磁力加上吸附至溶液透明，將上清轉移至新的EP 管中，加入300 μL Buffer ACB 混勻后，將溶液加入UCP MinElute Column 中，6 000 g 離心1 min，加入500 μL buffer ACW2 至 吸 附 柱 中，6 000 g 離 心1 min，20 000 g離心3 min。將吸附柱轉移至新的EP管中，56 ℃下開蓋晾3 min，隨后加入20~80 μL 去離子水至吸附柱中央，室溫孵育1 min，20 000 g 離心1 min 收集DNA 溶液。DNA 提取完成后采用超微量紫外分光光度計檢測DNA 濃度及OD260/OD280，OD260/OD280值1.8~2.0。

1.4 腫瘤組織、胸腔積液及血液中EGFR 基因突變檢測 采用擴增阻遏突變系統-實時熒光定量聚合酶鏈反應。取腫瘤組織、胸腔積液及血液標本，人類EGFR 突變基因檢測試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技股份有限公司，試劑盒采用的8連PCR 條設計，主要檢測EGFR 外顯子18、19、20 和21 位點中常見的突變類型，包含19-Del、L858R、T790M、G719X、S768I 和L861Q 突變等，每個PCR 反應管內均含有5~10 pmol/L 特異性引物、20 pmol/L 雙環探針、

12.5 μmol/L dNTPs、175 μmol/L 氯化鎂、1 mmol/L硫酸銨、2.5 mmol/L 氯化鉀和純化水等。通過ABI7500 實時熒光PCR 儀進行檢測。反應條件：95 ℃10 min；95 ℃40 s、64 ℃40 s、72 ℃30 s，15 個循環；93 ℃40 s、60 ℃45 s、72 ℃30 s，28 個循環。60 ℃時收集FAM/ROX/CY5（VIC）信號。按照試劑盒說明書提供的判讀原則確定樣本EGFR 基因突變類型。

1.5 腫瘤組織及胸腔積液中PD-L1 蛋白表達檢測 采用免疫組化法。將石蠟切片68 ℃烤片20 min 后，常規脫蠟復水，3%H2O2室溫孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶。將稀釋后的胰蛋白酶滴加到組織上抗原修復后，用含5%BSA 封閉液封閉，滴加適當比例稀釋（1∶200）的PD-L1 兔單克隆抗體，4 ℃孵育過夜；PBS 清洗，加入HRP 標記的二抗孵育30 min；PBS 清洗后，DAB 顯色，在顯微鏡下觀察棕色深淺，當顏色達到最優后用自來水沖洗；蘇木素復染；隨后脫水、封片、固片；顯微鏡下觀察并照相、記錄。結果判定標準：由三位病理醫師對檢測結果進行評估。顯微鏡下隨機取5 個視野，用陽性細胞百分比≥50%為高表達，1%≤陽性細胞百分比＜50%為低表達，陽性細胞百分比＜1%為無表達。

1.6 統計學方法 采用SPSS24.0 統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗、Fisher’s精確概率法；不同樣本類型檢測結果一致性用Kappa檢驗，Kappa＞0.75 為一致性較好，0.4≤Kappa≤0.75 為一致性一般，Kappa＜0.4為一致性差。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各樣本中EGFR基因突變檢測的一致性 ①腫瘤組織中共檢測出52 例EGFR 基因突變，突變率為34.67%（52/150），突變類型包括19-del、L858R、T790M 及18 外 顯子G719X 和20 外 顯子S768I 共 突變，分別占50%（26/52）、46.15%（24/52）、1.92%（1/52）、1.92%（1/52）。②胸腔積液中共檢測出44例EGFR 基因突變，基因突變率為29.33%（44/150），突變類型包括19-del、L858R、T790M 及18 外顯子G719X 和20 外顯子S768I 共突變，分別占

45.45 %（20/44）、50%（22/44）、2.27%（1/44）、2.27%（1/44）。③血液中共檢測出40例EGFR 基因突變，基因突變率為26.67%（40/150），突變類型包括19-del、L858R 及18 外 顯 子G719X 和20 外 顯 子S768I 共突變，分別占50%（20/40）、47.5%（19/40）、2.5%（1/40），但血液有1 例T790M 突變患者未檢出。各樣本中EGFR 基因突變類型檢出情況比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

150 例NSCLC 患者中，胸腔積液與腫瘤組織中EGFR 基因突變檢測結果一致142 例，不一致8 例；血液與腫瘤組織中EGFR 基因突變檢測結果一致138 例，不一致12 例；胸腔積液與血液中EGFR 基因突變檢測結果一致146 例，不一致4 例。胸腔積液、血液與腫瘤組織中EGFR 基因突變檢測結果一致性較好（Kappa分別為0.878、0.813，P均＜0.05）；胸腔積液與血液中EGFR 基因突變檢測結果一致性較好（Kappa=0.934，P＜0.05）。見表1、2。

表1 胸腔積液、血液與腫瘤組織樣本中EGFR基因突變檢測結果的一致性

2.2 胸腔積液與腫瘤組織中PD-L1 蛋白表達一致性比較 以陽性細胞百分比≥50%為閾值時，腫瘤組織中PD-L1 蛋白陽性表達率為16.67%（25/150），胸腔積液中PD-L1 蛋白陽性表達率為4.67%（7/150）。以腫瘤組織樣本陽性結果為真陽性，則胸腔積液檢測結果為假陰性19例、假陽性1例，胸腔積液與腫瘤組織中PD-L1 蛋白表達檢測結果一致率為86.67%（130/150），一致性較差（Kappa=0.326，P＞0.05）。

表2 血液與胸腔積液中EGFR基因突變檢測結果的一致性

以陽性細胞百分比≥1%為閾值時，腫瘤組織中PD-L1 蛋白陽性表達率為60.6%（91/150），胸腔積液中PD-L1 蛋白陽性表達率為28.67%（43/150）。當以腫瘤組織陽性結果為真陽性，則胸腔積液檢測結果為假陰性48例、假陽性3例，胸腔積液與腫瘤組織中PD-L1 蛋白表達檢測結果一致率為66%（99/150），一致性較差（Kappa=0.367，P＞0.05）。

3 討論

NSCLC 的精準治療在所有實體腫瘤治療中是發展較快，接受傳統化療的轉移性NSCLC 患者5 年相對生存率只接近6%，但是接受靶向治療或免疫檢查點抑制劑治療的轉移性NSCLC患者的5年相對生存率提高至15%~50%［7］。驅動基因突變以及PD-L1表達檢測是決定患者選擇治療方法及治療藥物的前提條件。合適的樣本類型對于快速、準確的檢測患者驅動基因突變以及PD-L1 表達，篩選出適合靶向治療和免疫治療的患者具有重要的臨床意義。

目前NSCLC 診斷樣本類型多為腫瘤組織，但高達30%的晚期NSCLC 患者無任何可用的組織標本；除此之外，腫瘤組織樣本類型不適合多次采樣，難以用于動態監測驅動基因突變情況和檢測靶向治療是否出現耐藥，無法指導臨床適時調整患者治療方案。因此，對于無法獲得腫瘤組織的患者，亟需尋找新的檢測樣本類型。研究表明，血液樣本中的循環游離DNA（cfDNA）可用于驅動基因突變檢測。另外，胸腔積液是晚期NSCLC 患者常見并發癥，是腫瘤細胞的常見來源，也是驅動基因突變檢測的重要樣本類型［9］。血液和胸腔積液樣本可以通過相對無創的方式重復獲取，對于無法獲取組織標本的NSCLC 患者而言，血液和胸腔積液樣本用于EGFR基因突變檢測不失為一個不錯的選擇。本研究對150 例同時有腫瘤組織、胸腔積液和血液樣本的NSCLC患者的EGFR基因突變進行分析，EGFR基因突變率為34.67%，EGFR 突變類型主要為19-del 和L858R，不同樣本類型檢出均無差異。除此之外，血液、胸腔積液和腫瘤組織樣本均檢測出一例EGFR 18 外顯子G719X 和20 外顯子S768I 共突變。黃建等［10］研究表明，胸腔積液與腫瘤組織樣本檢測EGFR 基因突變狀態一致性極好，而血液與腫瘤組織樣本檢測EGFR 基因突變一致性良好。但本研究結果中，胸腔積液、血液與配對腫瘤組織樣本檢測EGFR 基因突變狀態一致性均極好；但與胸腔積液樣本相比較，血液樣本有4 例患者未檢測出EGFR基因突變，尤其是1 例EGFR T790M 突變患者在腫瘤組織和胸腔積液細胞蠟塊中均被檢測出，在血液樣本中未檢測出該突變，造成血液樣本漏檢的原因可能是血液中cfDNA 濃度較低，未達到ARMS 法檢測EGFR 基因突變的檢測下限［11］。仍需要靈敏度更高的方法來進一步確定血液樣本檢測EGFR 基因突變的可行性。張平等［12］利用高通量測序技術比較了肺腺癌患者胸腔積液、腹水、心包積液和腦脊液中EGFR 基因突變狀態，發現這些體液樣本的上清游離DNA 的EGFR 基因突變豐度顯著高于體液沉積腫瘤細胞和血漿游離DNA 樣本，其中血漿cfDNA 檢出率最低，在腫瘤部位附近采集的體液或細胞學樣本的基因突變豐度高于血漿cfDNA。由此可見，雖然血液和胸腔積液樣本與腫瘤組織的EGFR 基因突變檢測結果一致性均極好，但從檢出率的角度來說，血液樣本劣于胸腔積液樣本，所以對于難以獲得腫瘤組織且伴有胸腔積液并發癥的NSCLC 患者，可以優先考慮胸腔積液樣本作為EGFR 基因突變檢測首要樣本。

免疫檢查點抑制劑對無靶向基因突變的NSCLC 患者治療有效，已經成為靶向治療耐藥和化療耐藥的晚期轉移性NSCLC 患者的標準療法。檢測腫瘤組織表面PD-L1表達是篩選潛在接受免疫檢查點抑制劑治療的獲益人群的重要標準，目前免疫組織化學法檢測腫瘤組織PD-L1表達是檢測的金標準。胸腔積液中也包含大量的腫瘤細胞，雖然胸腔積液樣本在靶向驅動基因突變檢測應用已經得到臨床認可，但是否可以作為PD-L1 表達檢測的樣本類型用于篩選免疫治療獲益人群目前還未有統一說法。血液中循環腫瘤細胞（CTC）可以用來檢測PD-L1蛋白表達，但血液中CTC 含量極低，需要對CTC 進行富集處理，操作過程較復雜，且目前試劑盒較少。除此之外，CTC 中PD-L1 陽性表達的結果判讀還未有明確的指南推薦。本研究考慮到成本及結果判讀的難度，未做血液樣本的PD-L1 蛋白表達檢測。在本研究中，通過免疫組織化學分析了150 例NSCLC 患者腫瘤組織樣本和配對胸腔積液細胞蠟塊樣本中PD-L1 表達水平，其中腫瘤組織中PD-L1 高表達率為16.67%，胸腔積液細胞蠟塊樣本中PD-L1高表達率為4.67%，這與相關研究的PD-L1 在胸腔積液樣本中表達率為3.5%的結論基本一致［13］。但是低于馬海玥等［14］的研究結果。造成這種不同結果的原因可能是，不同實驗室檢測PD-L1 表達所使用的的檢測平臺，抗體種類有所不同，除此之外，不同實驗室在制備胸腔積液細胞蠟塊過程中選擇固定劑類型、固定時間的長短以及制備方法都存在一定的差異。當以陽性細胞百分比≥50%為閾值時，腫瘤組織和胸腔積液細胞蠟塊樣本的一致性為86.67%；但是當以陽性細胞百分比≥1%為閾值時，兩種樣本類型的一致率降低至66%，一致性為0.367。表明低陽性細胞百分比閾值篩選陽性樣本可能會造成誤判，這與葉偉等［15］的研究結果相似。但是GROSU 等［16］通過比較NSCLC 患者腫瘤組織樣本和配對的胸腔積液細胞塊樣本中的PD-L1 表達情況，檢測結果一致性為0.78，一致性極好。另外，在本研究中，當以陽性細胞百分比≥50%為閾值時，有1 例患者的胸腔積液細胞蠟塊和腫瘤組織樣本中PD-L1表達結果不一致。當以陽性細胞百分比≥1%為閾值時，有3 例患者患者胸腔積液細胞學樣本PD-L1 表達陽性，而腫瘤組織樣本表達陰性，這可能是腫瘤異質性造成的，有研究表明，使用相同的實驗平臺和檢測抗體，在NSCLC 患者同一腫瘤組織蠟塊的不同切片中檢測PD-L1 表達，得到的結果也不盡相同［17］，可見同一瘤體內存在著細胞的異質性。胸腔積液是晚期NSCLC 患者轉移樣本，而組織樣本是多為患者的原發灶，由于NSCLC 細胞異質性，可能有些組織樣本PD-L1 表達陰性患者在轉移胸腔積液細胞學樣本中PD-L1 陽性，因此，胸腔積液細胞學樣本可以篩選出一部分腫瘤組織樣本PD-L1陰性但適合免疫檢查點抑制劑治療的患者。但是胸腔積液細胞學樣本中評估PD-L1的表達仍具有很多挑戰，例如，胸腔積液細胞學樣本中含有大量的非腫瘤細胞，如巨噬細胞、間皮細胞和炎癥細胞等，這些細胞也會表達部分PD-L1，影響結果。雖然有研究提示，樹突狀細胞和巨噬細胞的PD-L1 表達量均與免疫檢查點抑制劑療效相關，非腫瘤細胞PD-L1 表達量越高療效越好［18］。但還需要大量研究進一步證實。除此之外，胸腔積液中的腫瘤細胞數量也會影響PD-L1 檢測結果，研究發現，在少于100個細胞的細胞塊中，檢測結果與相應的手術標本的檢測結果一致性較低［19］。

綜上所述，血液、胸腔積液標本檢測EGFR 基因突變與腫瘤組織標本相比具有較好的一致性，并且胸腔積液和血液樣本可以多次、微創采取，在腫瘤組織缺乏時，可以考慮采用血液、胸腔積液標本進行EGFR 基因檢測。另外PDL-1 在胸腔積液中的表達與腫瘤組織檢測結果一致性差，可能在制備細胞蠟塊過程中試劑的選擇以及處理方式都需要優化，仍需要大量研究來探討針對細胞學樣本進行PD-L1免疫組織化學檢測的規范化操作。