吸入性甲烷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠NFE2L2和HO-1表達(dá)及氧化應(yīng)激的影響

張寶成 李榮新 鐘志越 (復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院急危重病中心，上海 201508)

腦卒中是包括缺血性和出血性腦卒中，其中70%為缺血性腦卒中〔1,2〕。由于腦卒中多為急性發(fā)作，一直缺乏有效的治療手段，因此腦卒中成為當(dāng)今世界人類主要的死亡誘因之一〔3,4〕。腦卒中缺血發(fā)生后血液再灌注是治療的第一步，但同時(shí)這也會(huì)引起嚴(yán)重腦部損傷，即腦缺血再灌注損傷，目前也缺乏有效的治療方法〔5～7〕。探索修復(fù)腦缺血再灌注的治療方法和分子機(jī)制對(duì)于腦卒中臨床治療具有重要的科學(xué)和臨床價(jià)值。甲烷是天然氣主要成分，也是公認(rèn)的對(duì)人體有害物質(zhì)，但是低濃度的吸入性甲烷卻可以修復(fù)腦缺血再灌注引起的損傷。本文探討吸入性甲烷對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠紅細(xì)胞衍生核因子2樣蛋白(NFE2L2)和血紅素氧合酶(HO)-1表達(dá)及氧化應(yīng)激影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠雄性36只，清潔性飼養(yǎng)，體重(220±20)g，室溫(23±2)℃，濕度50%～70%，自由飲食飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2主要試劑 NFE2L2一抗(博士德生物工程有限公司)，大鼠HO-1、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒(上海康朗生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及給藥 36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組各12只。實(shí)驗(yàn)組給予吸入性甲烷10 ml/kg，1次/d；假手術(shù)組和模型組給予等劑量生理鹽水吸入，1次/d。各組大鼠連續(xù)15 d。

1.3.2腦缺血再灌注損傷大鼠模型制備 腦缺血再灌注損傷大鼠模型采用改良Longa法制備，于末次給藥2 h后，給予350 mg/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，于大鼠頸中切口；暴露分離大鼠左頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，將大鼠頸外動(dòng)脈根部和頸總動(dòng)脈近心端給予結(jié)扎；大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈采用顯微動(dòng)脈夾夾閉，在頸總動(dòng)脈結(jié)扎處附近打一活結(jié)；并且在頸總動(dòng)脈結(jié)扎與活結(jié)處間剪開一切口，從頸總動(dòng)脈將線栓緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，感受到明顯阻力時(shí)停止，且系緊活結(jié)。再于大鼠腦缺血2 h后，將線栓拔出15 mm左右，形成再灌注，而其中假手術(shù)組不將線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，其余處理方法相同。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 評(píng)分0～4分，評(píng)分越高神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4.2腦梗死面積計(jì)算 處死大鼠取腦，采用紅四氮唑(1%)將大鼠正常腦組織被染成紅色，而梗死區(qū)域呈白色。腦梗死面積百分比運(yùn)用Image pro plus6.0軟件計(jì)算。

1.4.3腦組織含水量測定 采用干濕重法測定腦組織含水量。

1.4.4NFE2L2蛋白測定 采用Western印跡測定大鼠腦組織NFE2L2蛋白，取大鼠腦組織，低溫下反復(fù)研磨制備腦組織勻漿；加入放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液適量，放置于4℃離心后取上清，總蛋白濃度采用二喹啉甲酸(BCA)法測定。以20 μg總蛋白上樣，行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；封閉、漂洗，加入NFE2L2一抗(1∶500)，在4℃過夜，加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(1∶2 000)；洗膜，發(fā)光顯影，曝光拍照。以Image pro plus6.0圖像處理，以NFE2L2與GADPH蛋白表達(dá)灰度值表示NFE2L2蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5HO-1表達(dá)測定 取大鼠腦組織，以半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心6 min，取上清液，置于-20℃下保存待測，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定HO-1表達(dá)。

1.4.6氧化應(yīng)激測定 取大鼠腦組織，以半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心6 min，取上清液，置于-20℃下保存待測，采用分光光度法測定腦組織SOD、GSH-Px和MDA表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死面積百分比和腦組織含水量比較

2.2各組NFE2L2蛋白表達(dá)比較 模型組(1.07±0.16)和實(shí)驗(yàn)組腦組織NFE2L2蛋白表達(dá)(1.35±0.19)明顯低于假手術(shù)組(1.69±0.21，P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組腦組織NFE2L2蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組NFE2L2蛋白表達(dá)

2.3各組腦組織HO-1表達(dá)比較 模型組〔(1.89±0.46) mmol/L〕和實(shí)驗(yàn)組腦組織HO-1表達(dá)〔(3.78±1.04)mmol/L〕明顯低于假手術(shù)組〔(5.32±1.29)mmol/L,P<0.05〕；實(shí)驗(yàn)組腦組織HO-1表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)。

2.4各組氧化應(yīng)激變化比較 模型組和實(shí)驗(yàn)組腦組織SOD和GSH-Px水平明顯低于假手術(shù)組，而MDA水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組腦組織SOD和GSH-Px水平明顯高于模型組，而MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 各組氧化應(yīng)激變化比較

3 討 論

腦血管病作為老年人群的常見慢性病，其發(fā)病率占缺血性腦血管病80%左右〔8～12〕。目前，藥物治療腦缺血再灌注損傷效果并不十分理想，且毒副作用較大。甲烷是自然界中最常見的烷烴和天然氣的主要成分，通常作為燃料使用。然而，研究發(fā)現(xiàn)生物機(jī)體內(nèi)源性的甲烷具有十分重要的生理功能，尤其在對(duì)抗缺血再灌注損傷方面作用顯著〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)甲烷通過抗炎癥、抗氧化和抗凋亡等方式保護(hù)肝、脊髓、眼睛、皮膚及腸等器官和組織免受缺血再灌注損傷〔14〕。低濃度的吸入性甲烷卻可以修復(fù)腦缺血再灌注引起的損傷。然而，低濃度吸入性甲烷保護(hù)機(jī)體免受腦缺血再灌注損傷的機(jī)制仍不明確。由本研究結(jié)果可見吸入性甲烷可減輕大鼠神經(jīng)功能缺損，降低大鼠腦梗死面積和腦組織含水量。

HO-1屬重要的一種免疫調(diào)節(jié)分子和炎癥抑制因子，在穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊及抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展中發(fā)揮作用。NFE2L2是調(diào)控HO-1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)HO-1表達(dá)具有正調(diào)控作用。研究表明，富甲烷鹽水通過上調(diào)NFE2L2和HO-1表達(dá)來降低脊髓缺血再灌注損傷產(chǎn)生的炎性因子和氧化產(chǎn)物，從而保護(hù)大鼠脊髓免受損傷〔15〕。本研究表明吸入性甲烷可上調(diào)NFE2L2蛋白和HO-1表達(dá)。

腦缺血再灌注損傷的病理機(jī)制中氧化應(yīng)激是重要之一，由于腦組織血氧量高、代謝旺盛，則會(huì)造成生成較多的活性氧(ROS)，但由于腦組織自身缺血抗氧化物質(zhì)，而易受ROS侵害，且會(huì)在代謝反應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)下和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，直接損傷核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)大分子，從而造成細(xì)胞死亡。其中SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化物酶，不僅能夠清除細(xì)胞中ROS，同時(shí)還具有保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用；MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一種終產(chǎn)物，其水平高低能夠反映氧化應(yīng)激程度。本研究表明吸入性甲烷可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平。

綜上，吸入性甲烷可減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損，上調(diào)NFE2L2蛋白和HO-1表達(dá)及調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平。