老年2型糖尿病視網(wǎng)膜病變外周血miR-451水平檢測及其臨床意義

陳王靈 勞偉 陳運(yùn)信 梁曉茜 丁輝

(中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院(海南省眼科醫(yī)院) 海南省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570311)

2型糖尿病視網(wǎng)膜病變是2型糖尿病患者視網(wǎng)膜微血管病變并發(fā)癥，該病可致使患者出現(xiàn)視力障礙〔1〕。近年來我國2型糖尿病的發(fā)病率逐年上升，各種并發(fā)癥發(fā)生人數(shù)也不斷增多，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在糖尿病患者中發(fā)生視網(wǎng)膜病變的占比高達(dá)70%以上〔2〕。糖尿病視網(wǎng)膜病變是一個動態(tài)演變的過程，該過程分為視網(wǎng)膜病變前期即非增殖期和增殖期〔3〕。而臨床對于視網(wǎng)膜病變的程度一般都是通過相關(guān)眼科外觀檢查進(jìn)行判定，但是對其與分期發(fā)展的機(jī)制認(rèn)識尚淺。有研究表明，miR-451可以負(fù)調(diào)控糖尿病患者體內(nèi)的血糖水平〔4〕，視網(wǎng)膜病變作為糖尿病并發(fā)癥之一，其病變程度與血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)水平呈正相關(guān)〔5〕，而miR-451對血管內(nèi)皮生長因子具有負(fù)調(diào)節(jié)作用〔6〕，推測miR-451的表達(dá)可能參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展，但是目前人們對于外周血miR-451是否參與老年2型糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的相關(guān)認(rèn)識尚淺。鑒于此，本研究對老年2型糖尿病患者的臨床資料進(jìn)行回顧分析，探討上述問題，以期為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析2015年8月至2019年10月中山大學(xué)中山眼科中心海南眼科醫(yī)院收治的121例老年2型糖尿病者的臨床資料，其中83例并發(fā)視網(wǎng)膜病變的患者為并發(fā)組，未并發(fā)視網(wǎng)膜病變的38例患者為糖尿病組；另回顧性分析同期60例在醫(yī)院體檢的健康者的體檢資料作為對照組。其中并發(fā)組男34例，女49例，年齡60～81歲，平均(68.42±5.31)歲，2型糖尿病病程4個月至21年，平均(11.25±2.07)年，其中左眼視網(wǎng)膜病變21例，右眼視網(wǎng)膜病變23例，雙眼視網(wǎng)膜病變39例；糖尿病組男15例，女23例，年齡60～80歲，平均(69.15±6.02)歲，2型糖尿病病程3個月至16年，平均(7.45±1.30)年；對照組男25例，女35例，年齡60～80歲，平均(69.45±6.52)歲。3組研究對象年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均簽署本研究知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)組和糖尿病組患者均符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)〔7〕；②并發(fā)組均確診為視網(wǎng)膜病變；③對照組均為體檢健康者；④年齡≥60歲；⑤各組均有完整的資料信息。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能異常患者；②合并其他可能影響本研究結(jié)果疾病者，如2型糖尿病腎病、白內(nèi)障、青光眼等；③血液系統(tǒng)病變患者；④合并結(jié)締組織及其他免疫性疾病者；⑤惡性腫瘤者；⑥合并其他糖尿病相關(guān)并發(fā)癥者。

1.2方法 研究對象均采取外周靜脈血4 ml(并發(fā)組及糖尿病組患者于入院當(dāng)天采血，對照組于體檢當(dāng)天采血)，離心(轉(zhuǎn)速：3 500 r/min，時間10 min)，提取血清，置于-70℃冰箱保存?zhèn)錅y。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測研究對象外周血miR-451表達(dá)水平。用移液槍取血清加入細(xì)胞裂解液，用總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)提取RNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA純度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(羅氏)將總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以U6為內(nèi)參，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。PCR條件：95℃ 10 min，95℃變性10 s，60℃退火60 s，74℃延伸30 s，連續(xù)進(jìn)行40次循環(huán)，每個樣品均設(shè)3個平行反應(yīng)孔。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行miR-451的相對定量分析。

糖尿病視網(wǎng)膜病變分期：參照2002年糖尿病視網(wǎng)膜病變國際臨床分級標(biāo)準(zhǔn)〔8〕分為非增殖期、增殖期和高危增殖期，其中非增殖期包括輕度(僅有微血管瘤)、中度(微血管瘤存在且輕于重度表現(xiàn))、重度(任一象限有>20處視網(wǎng)膜內(nèi)出現(xiàn)或有>2個象限有靜脈串珠樣改變或>1個象限有顯著視網(wǎng)膜內(nèi)微血管異常)，增殖期(新生血管形成、視網(wǎng)膜前出血或玻璃體積血)，高危增殖期(距視盤1個視盤直徑范圍內(nèi)有新生血管，面積>1/3視盤面積，玻璃體或視網(wǎng)膜前出血，伴有不廣泛的視盤或視網(wǎng)膜其他部位新生血管，面積>1/2視盤面積)。

1.3觀察指標(biāo) (1)對比3組外周血miR-451的表達(dá)水平；(2)對比并發(fā)組不同糖尿病視網(wǎng)膜病變分期者外周血miR-451的表達(dá)水平；(3)分析外周血miR-451的表達(dá)水平對2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷效能。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以受試者工作特征(ROC)曲線分析外周血miR-451的表達(dá)水平對2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷價值。

2 結(jié) 果

2.13組miR-451表達(dá)水平 并發(fā)組外周血miR-451表達(dá)水平(15.52±2.71)低于糖尿病組(29.25±5.89)和對照組(37.08±6.45，P<0.05)，糖尿病組外周血miR-451表達(dá)水平低于對照組，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2并發(fā)組不同視網(wǎng)膜病變分期患者外周血miR-451表達(dá)水平 增殖期視網(wǎng)膜病變患者(30例)外周血miR-451表達(dá)水平(6.70±1.85)低于高危增殖期(15.26±2.18，12例)和非增殖期視(22.05±6.17，41例)網(wǎng)膜病變患者，高危增殖期視網(wǎng)膜病變患者低于非增殖期視網(wǎng)膜病變患者，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3外周血miR-451表達(dá)水平對2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷效能 以不同的miR-451表達(dá)水平值診斷2型糖尿病視網(wǎng)膜病變最佳截?cái)帱c(diǎn)為21.03，靈敏度為100.00%，特異度為92.11%，ROC曲線下面積為0.985，95%CI：0.944～0.998。見圖1。

圖1 外周血miR-451表達(dá)水平對2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷ROC曲線

3 討 論

目前，臨床尚未完全明確糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制，相關(guān)研究學(xué)者認(rèn)為該病與微血管病變、新生和內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷和增殖有關(guān)〔9〕。所以糖尿病患者做好視力檢查，對于發(fā)生視網(wǎng)膜病變的診斷和評估至關(guān)重要。目前臨床上常用裂隙燈下眼底檢查、眼底熒光血管造影(FFA)判斷2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生情況和分期，雖然快速、精確，但難以了解該病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制。

本研究結(jié)果提示糖尿病者及并發(fā)視網(wǎng)膜病變患者外周血miR-451表達(dá)水平下降；外周血miR-451表達(dá)水平下降可能與視網(wǎng)膜病變的分期有關(guān)。miR-451定位于人類基因組中17q11.2，是miRNAs的重要成員，在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變中血管的變化與血-視網(wǎng)膜屏障毛細(xì)血管的細(xì)胞損傷和病理變化過程中多種miRNAs均有參與〔10〕。miRNAs是一類非編碼的單鏈RNA，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平通過干擾mRNA堿基互補(bǔ)配對方式負(fù)性調(diào)控表達(dá)，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程〔11〕。新生血管的形成使糖尿病視網(wǎng)膜病變的一個重要的病理改變，且miRNAs與之緊密相關(guān)，在內(nèi)皮細(xì)胞、血管周細(xì)胞等多種信號通路傳導(dǎo)中miRNAs均處于關(guān)鍵地位，可參與視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖、凋亡調(diào)控及視網(wǎng)膜病變相關(guān)的新血管形成，在2型糖尿病視網(wǎng)膜病變中有至關(guān)重要的作用。而miR-451對血管內(nèi)皮生長因子呈現(xiàn)負(fù)性調(diào)控，當(dāng)miR-451表達(dá)水平降低時，可導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子升高〔12〕，進(jìn)一步促使視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞進(jìn)行增殖，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變并加重其病變程度。有動物實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病小鼠體內(nèi)miR-451表達(dá)水平低于正常小鼠〔13〕，研究結(jié)果與本研究保持一致。另有研究表明〔14〕，升高miR-451的表達(dá)量可顯著減少視網(wǎng)膜新生血管形成，減輕視網(wǎng)膜病變程度。結(jié)合本研究結(jié)果和上述分析，推測miR-451表達(dá)下降可能是2型糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生和發(fā)展的重要因素。

此外，本研究采用ROC曲線分析外周血miR-451表達(dá)水平對老年2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的診斷效能，發(fā)現(xiàn)其效能良好。分析其中原因可能為：糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血miR-451表達(dá)水平過低，可增加血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)量升高，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖、凋亡紊亂，促進(jìn)視網(wǎng)膜病變相關(guān)的新血管形成，同時還可改變視網(wǎng)膜血管通透性，參與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，老年2型糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血miR-451表達(dá)水平低于單純糖尿病者和健康者，且與視網(wǎng)膜病變分期有關(guān)，外周血miR-451表達(dá)水平對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有較好的診斷效能，可以應(yīng)用于臨床。根據(jù)本研究推測外周血miR-451低表達(dá)可能參與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生和發(fā)展，但其具體的作用機(jī)制仍需要深入研究，可作為后期探討的重點(diǎn)。