Toll樣受體4、絲切蛋白-1及可溶性白細胞介素-2受體在肝癌患者組織中的表達及意義

彭旭 李亭 李鐸 鄒瑞 林繼旺

(1海南省腫瘤醫院肝膽胰外科，海南 海口 570100；2中南大學湘雅二醫院普外器官移植科)

肝癌多發生于機體肝臟上皮組織，威脅患者身體健康、生活質量〔1，2〕。肝癌具有發病隱匿、病情發展較快、惡性程度較高等特點，且具有一定的地區、性別差異性〔3〕。肝癌發病早期無明顯臨床癥狀，確診率較低，導致大多數肝癌患者確診時病情已發展至晚期，對患者的身體健康甚至生命安全造成嚴重威脅〔4～6〕。Toll樣受體(TLR)4、絲切蛋白(ADF)-1、可溶性白細胞介素(SIL)-2在惡性腫瘤中均呈現異常表達，但是關于三者在肝癌中的表達變化及相關性的研究還鮮有報道。本研究探討TLR4、ADF-1、SIL-2受體(SIL-2R)在肝癌中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取2018年10月至2019年10月海南省腫瘤醫院收治的肝癌患者50例，男27例，女23例，年齡50～70歲，平均(60.2±8.1)歲。排除標準：①非手術治療患者；②接受過相關治療者；③并發其他惡性腫瘤者；④心、腎、肺等器官功能不全者。本研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2標本采集 取所有患者手術切除癌組織標本及距癌組織5 cm以上的癌旁組織，4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋，厚度3 μm，連續切片作免疫組化標記。

1.3Western印跡檢測TLR4、ADF-1表達 使用磷酸鹽緩沖液(PBS)對標本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質，添加蛋白緩沖液后進行電泳，10 min后將電轉膜置于10%的牛奶中浸泡，常溫環境下封閉90 min。之后結合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結合二抗，60 min后清洗、顯色，對TLR4、ADF-1表達進行檢測。

1.4酶聯免疫吸附試驗檢測SIL-2R表達 取50 mm碳酸鹽包緩沖液對抗原進行稀釋，將其加入聚苯乙烯的反應孔中，加蓋處理后，在溫度4℃的條件下放置24 h，次日洗滌3次后，拋干，在每孔中均加入稀釋液稀釋的待測標本0.1 ml，并加入陽性和陰性對照標本，在溫度為42℃的條件下放置60 min，將液體移除并洗滌3次后，拋干，在每孔中加入抗體0.1 ml，再次放置60 min，將液體移除并洗滌3次，拋干，并在每孔中加入低物液混勻，且加入0.1 ml鄰苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔內，終止反應。使用酶標儀檢測A450值，分析SIL-2R表達。

1.5免疫組化染色 對待測標本進行脫蠟、水化等處理之后，將其在0.01 mol/L、95℃的枸櫞酸緩沖液中浸泡，并進行熱修復，3% H2O2環境下培育10 min，滴入山羊血清，26℃環境中培養30 min，抽離封閉液、添加一抗，將其置于5℃的環境中過夜培養，次日加入二抗，37℃恒溫箱中培養30 min，清洗后進行二氨基聯苯胺(DAB)顯色、封片。

1.6統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、t檢驗、Pearson相關分析。

2 結 果

2.1TLR4、ADF-1、SIF-2R在肝癌組織、癌旁組織中的表達對比 肝癌癌組織中TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于癌旁組織(均P<0.001)。見表1，圖1。

表1 TLR4、ADF-1、SIL-2R在癌肝組織、癌旁組織中的表達

圖1 TLR4、ADF-1、SIL-2R的表達免疫組化染色(×200)

2.2不同因素腫瘤組織中TLR4、ADF-1、SIL-2R表達 腫瘤體積≥5 cm3患者TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于腫瘤體積<5 cm3患者(P<0.05，P<0.01)。病理分期為Ⅲ+Ⅳ的患者TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于病理分期為Ⅰ+Ⅱ的患者(P<0.05)。有淋巴結轉移的患者TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于無淋巴結轉移情況的患者(P<0.05)。低分化患者TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于中分化、高分化患者，中分化患者TLR4、ADF-1、SIL-2R表達顯著高于高分化患者(P<0.05)。見表2。

表2 不同因素腫瘤組織中TLR4、ADF-1、SIL-2R表達

2.3肝癌組織中TLR4、ADF-1、SIL-2R表達之間相關性 組織中TLR4與ADF-1(r=0.446，P=0.001)、SIL-2R表達呈顯著正相關(r=0.314，P=0.027)；肝癌組織中ADF-1與SIL-2R表達呈顯著正相關(r=0.462，P=0.001)。

3 討 論

近年來，我國肝癌發病率連年上升，引起廣大專家學者的關注〔7〕。目前我國肝癌的早期診斷率較低，大多數患者確診時病情已發展至晚期，已錯失治療的最佳時期〔8〕。有學者〔9，10〕通過分子生物學、基礎醫學等途徑對肝癌發病機制進行研究，旨在提升肝癌早期診斷率、臨床治療效果及改善肝癌患者預后。作為天然免疫受體家族，TLRs家族在機體免疫反應、炎癥反應中具有關鍵作用〔11〕。除此之外，TLRs家族還參與機體細胞增殖及組織修復等生理、病理過程〔12〕。有研究表明，TLR4作為TLRs家族的重要成員，參與腫瘤組織的發生發展及癌變〔13〕。有學者通過研究發展，TLR4在肺癌、食管癌、大腸癌等惡性腫瘤中呈現異常表達，但是關于TLR4表達與肝癌患者臨床特征相關性的研究相對較少〔14～16〕。本研究結果說明，TLR4在肝癌組織中呈現異常高表達，TLR4的異常表達可能與肝癌的發生發展具有一定的關聯。TLR4表達的變化與肝癌病理特征具有相關性。ADF-1是ADF家族成員〔17〕。ADF-1在肺癌、結腸癌、卵巢癌、食管癌等惡性腫瘤中呈現異常高表達，參與惡性腫瘤組織的發生發展。ADF-1的異常高表達與癌細胞的增殖、侵襲、遷移及放射敏感性具有密切聯系〔18，19〕。本研究結果說明，ADF-1的異常表達參與肝癌的發生發展。ADF-1表達變化與肝癌病理特征具有相關性。

肝癌的發生、演進與機體細胞免疫功能變化具有密切聯系，SIL-2R是臨床較為常用的評價機體細胞免疫功能的指標〔20〕。SIL-2R在惡性腫瘤患者中表達異常升高，與患者療效及預后具有密切聯系，SIL-2R在肝癌中呈現異常高表達，其表達變化與患者預后密切相關，但是關于SIL-2R表達變化與肝癌患者病理特征相關性的研究還相對較少〔21，22〕。本研究結果說明，SIL-2R表達的變化參與肝癌的發生發展，與肝癌病理特征具有相關性。