基于共有峰率和變異峰率雙指標序列法的桔梗樣品紅外光譜指紋圖譜研究*

丁 波，李國強，許 曼，陳 冉

（安徽省婦幼保健院，安徽 合肥 230001）

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC. 的干燥根，性平，味苦、辛，歸肺經，有宣肺、利咽、祛痰、排膿之功效，應用于祛痰止咳［1］。其主產于華北、東北、華中、華東及西南地區，資源分布廣泛，地域差異大，有效成分含量差異大，且市場上出現了桔梗科沙參或石竹科石竹等多種桔梗偽品［2］。采用單一方法鑒別存在耗時、耗試藥、操作煩瑣等問題，如通常采用的色譜法和光譜法等均需對藥材進行預處理。紅外光譜法具有高度的專屬性和特征性，為快速鑒別中藥材和分析化學結構的有效手段［3］。多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法在分析大樣本量時，可通過多維空間考察不同中藥樣品間的相互關系，并用數量精確表示該關系，克服了一般分析方法需要大量樣本的缺點，可區別2 個及以上的樣本［4］。本研究中采用溴化鉀壓片法制備桔梗樣品，采用紅外光譜法建立了不同產地桔梗樣品的紅外光譜指紋圖譜，并結合多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法對桔梗樣品進行產地區分和質量評價。現報道如下。

A. 桔梗皂苷D標準品 B. 桔梗樣品圖1 桔梗樣品與桔梗皂苷D標準品紅外光譜圖A.Standard samples of platycodin D B.Platycodonis Radix samplesFig.1 IR spectrograms of Platycodonis Radix samples and standard samples of platycodin D

A. 產地A B. 產地B C. 產地C D. 產地D E. 產地E F. 產地F G. 產地G圖3 不同產地桔梗樣品紅外光譜圖A.Produce area A B.Produce area B C.Produce area C D.Produce area D E.Produce area E F.Produce area F G.Produce area GFig.3 IR spectrograms of Platycodonis Radix samples from different produce areas

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nicolet Avatar FTIR370 型傅里葉紅外變換色譜儀（美國尼高力公司），配有氘代三甘氨酸硫酸酯檢測器；YB - 300A 型超細粉碎機（永康速鋒工貿有限公司）；PL601-S型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為千分之一）。

1.2 試藥

桔梗皂苷D 標準品（上海源葉生物科技有限公司，批號為P27A11F122502，純度不低于98%）；溴化鉀（分析純，上海邁坤化工有限公司，批號為20200313）。2 年生桔梗，產地分別為陜西郭興莊村（A）、安徽亳州（B）、安徽李興鎮尹寨村（C）、湖南（D）、安徽太和縣謝千村謝千莊（E）、河南黃土樓村（F）、浙江永興西街（G），采集時間2019 年10 月，由安徽中醫藥大學提供，并經安徽中醫藥大學俞年軍教授鑒定為正品，藥材標本存放于安徽省婦幼保健院藥劑科。

2 方法與結果

2.1 紅外光譜分析

2.1.1 紅外光譜參數

光譜范圍：4 000～400 cm-1；分辨率：4 cm-1；掃描次數：32次。掃描時實時扣除H2O和CO2的干擾。

2.1.2 樣品制備

分別取各產地桔梗藥材，置60 ℃溫度條件下干燥至恒重，粉碎，過9 號篩，桔梗藥材粉末與溴化鉀以1∶100（m/m）比例在紅外光燈下混合、研磨，均勻放入壓片模具內壓片，即得桔梗樣品。

2.1.3 方法學考察

重復性試驗：取桔梗藥材（產地為A）粉末6 份，按

2.1.2 項下方法制備桔梗樣品，按2.1.1 項下紅外光譜參數進行測定，記錄紅外光譜圖，并計算光譜圖中共有峰波數的RSD。結果的RSD= 0.92%（n= 6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取桔梗藥材（產地為A）粉末，按

2.1.2 項下方法制備桔梗樣品，分別于壓片后2，4，6，8，10，12 h時按2.1.1項下紅外光譜參數進行測定，記錄紅外光譜圖，并計算光譜圖中共有峰波數的RSD。結果的RSD=0.84%（n=6），表明樣品在12 h內穩定性良好。

2.1.4 紅外光譜分析

桔梗樣品與桔梗皂苷D 標準品：2020 年版《中國藥典（一部）》記載桔梗皂苷D 為桔梗的主要活性成分。其紅外光譜圖見圖1 A，主要特征吸收峰在1 729，1 646，1 362，1 220，1 026 cm-1波數處，其中1 729～1 650 cm-1波數處吸收峰為多種物質的疊加峰，主要為水中O—H 的彎曲振動、共軛羰基C＝O 的伸縮振動及芳香環骨架的振動［5-6］，1 729 cm-1波數附近出現的酯類羰基吸收峰為桔梗三萜皂苷類特征峰［7］；1 362 cm-1波數為C—H 的彎曲振動，1 026 cm-1波數為C—O 的伸縮振動［8］。桔梗樣品基本上保留桔梗皂苷D標準品的特征吸收峰，光譜圖見圖1 B。

不同產地的桔梗樣品：分別將7個產地的桔梗藥材按2.1.2 項下方法處理，按2.1.1 項下紅外光譜參數進行測定，不同產地桔梗樣品紅外光譜疊加指紋圖譜見圖2。由圖3 可知，7 個產地桔梗樣品的紅外光譜圖基本相似，其特征吸收峰在3 280，2 929，1 740，1 635，1 419，1 034，670，525 cm-1波數附近。其中，3 280 cm-1波數處為多糖類、苷類、糖醇類等化合物中羥基O—H 的伸縮振動［9］；2 929 cm-1波數處為亞甲基C—H 反對稱的伸縮振動［10］；1 740 cm-1波數附近出現的酯類羰基吸收峰為桔梗三萜皂苷類化合物的特征峰［11］；1 635 cm-1波數附近為多酚、多糖、蛋白質中C＝O 的伸縮振動；1 419 cm-1波數附近可能是C—H的彎曲振動；1 034 cm-1波數及其兩側肩峰為多個峰重疊而成的寬強峰，歸屬為多糖、苷類化合物中C—O 的彎曲振動；950 cm-1波數以下為糖環骨架的振動，670 cm-1和525 cm-1波數處為芳環（雜環）分子的骨架振動和變角振動，與桔梗中菊糖有關［11］。可見，桔梗中含有多糖及甾體皂苷類等化合物，且不同產地的桔梗樣品之間化學成分具有一定相似性。但不同產地桔梗樣品于1 740，1 635，1 419，1 034 cm-1波數附近吸收峰的位置、數目和強度存在一定差異，如產地B、產地E、產地F 的桔梗樣品相較于其他產地在1 740 cm-1波數處強度明顯，且產地B和產地E的桔梗樣品峰位置偏移46個波數；產地B、產地C、產地D的桔梗樣品在1 034 cm-1波數分別偏移了24 個、35 個、54 個波數，表明不同產地桔梗樣品的化合物成分和含量存在一定差異。故可根據特征吸收峰初步判斷桔梗的整體化學成分和產地。

圖2 不同產地桔梗樣品紅外光譜疊加指紋圖譜Tab.2 IR spectrograms superimposed fingerprints of Platycodonis Radix samples from different produce areas

2.2 共有峰率和變異峰率雙指標序列分析

2.2.1 雙指標序列分析

雙指標序列是指通過計算指紋圖譜共有峰率和變異峰率，根據共有峰率的大小排成的一個序列（包含共有峰率和變異峰率）。其中，共有峰率表示樣品之間的相似性，變異峰率表示差異性［12-13］。共有峰率大表明樣品差異小，變異峰率大表明樣品差異大。

共有峰率計算公式見公式（1）。

式中，P為共有峰率，Ng為共有峰數，Nd為獨立峰數。

Nd計算公式見公式（2）。

式中，Nd為相互比較的2個紅外光譜圖中的獨立峰總數，Na為紅外光譜指紋圖譜a中相對于其共有峰的非共有峰數，Nb為紅外光譜圖b中相對于共有峰的非共有峰數。

變異峰率計算公式見公式（3）。

式中，Pva（b）為變異峰率，Na（b）為紅外光譜圖中a（b）的總峰數。

2.2.2 共有峰率和變異峰率雙指標序列分析

根據公式計算7 個產地桔梗樣品之間紅外光譜圖的共有峰率和變異峰率，建立不同產地桔梗的雙指標序列。可在2+n維（n為樣品數）空間中量化各個樣品的異同，具有較強的鑒別力，進行相似性分析。如產地A：DE（63.6%；42.9%，14.3%）表明該序列以產地A 為標準計算產地B～G 樣品紅外光譜圖的共有峰率和變異峰率，表明產地A與產地DE的共有峰率為63.6%，其中產地A 變異峰率為42.9%，產地DE 變異峰率為14.3%。7 個產地桔梗樣品紅外光譜圖共有峰率和變異峰率雙指標序列分析結果見表1。

表1 不同產地桔梗樣品的共有峰率和變異峰率雙指標序列分析結果（%）Tab.1 Results of dual-index sequence analytical of common and variant peak ratio of Platycodonis Radix samples from different produce areas（%）

任一樣品與其他樣品有相同的共有峰率時，多數情況下變異峰不同，少數相同。如產地A：CD（50.0%；66.7%，33.3%），表明產地C 和產地D 相對于產地A 具有相同的共有峰率50%，但變異峰率不同，分別為66.7%和33.3%，可明顯區分產地C 和產地D。但產地C：DF（60.0%；33.3%，33.3%）序列中，產地D 和產地F相對于產地C具有相同的共有峰率和變異峰率，表明產地D 和產地F 相對于產地C 非常相似。因此，雙指標序列分析可從共性和變異性進一步發現不同產地桔梗的相似性和差異性。

2.2.3 基本關系組、對及分析

由表1 可知，產地C：E（100%；0，0）序列中，產地C、產地E 共有峰率為100%，變異峰率為0，分別對應安徽李興鎮尹寨村和安徽太和縣謝千村謝千莊，地理位置接近，氣候條件與生長環境相似，藥材質量相似度高；產地B 與產地C、產地G、產地E 的共有峰率均大于80%，表明產地B 與產地C、產地G、產地E 桔梗樣品含有相似的主要特征峰，化學成分很接近，對應產地分別為安徽亳州、安徽李興鎮尹寨村、浙江永興西街和安徽太和縣謝千村謝千莊，產地地理位置相對接近，氣候與自然條件相似；產地A 與其他產地的共有峰率為46.2%～63.6%，變異峰率大，整體相似度低，表明陜西與安徽、浙江、湖南桔梗的化學成分差異大，地理經度跨度大，具有明顯的地域差異。可見，產地接近、自然生長環境類似的桔梗間共有峰率高，反之則變異峰率高，可反映實際情況，說明該質量控制方法可指導實際生產。

3 討論

紅外光譜可用于定性鑒別和結構分析，且不需要進行樣品前處理，具有無損、快捷等優點，可用于不同產地桔梗的鑒別。多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法可建立不同樣品間最直接的相似性聯系［14-15］，與單指標分析法相比，雙指標指紋圖譜分析法具有較高的分辨率。如產地C：G（70.0%；14.9%，28.6%），產地G：CDEF（70.0%；28.6%，14.3%）中，產地C與產地G具有相同的共有峰率，而變異峰率不同，可更好地區分不同產地的桔梗樣品。

本研究中構建了7個產地桔梗樣品的紅外光譜指紋圖譜，通過多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法對不同產地的桔梗樣品進行鑒別分析及質量評價。結果不同產地桔梗樣品的紅外光譜圖基本相似，部分特征吸收峰的位置、數目和強度存在一定差異，表明不同產地桔梗整體上具有相似性，但其化合物成分和含量仍存在一定差異。產地接近的共有峰率大，變異峰率小，如安徽李興鎮尹寨村與太和縣謝千村謝千莊、湖南、河南黃土樓村的桔梗藥材來源接近，其變異峰率相差較小，而陜西與其他產地的共有峰率相差最大。由此推測不同產地桔梗藥材的化學成分及其含量受當地溫度、光照、土壤、水文等生態環境影響，與司雨柔等［11］的研究結果一致。

綜上所述，紅外光譜技術結合多維共有峰率和變異峰率雙指標序列法可準確、直觀地鑒別不同產地的桔梗，為不同中藥產地的鑒定提供試驗基礎，也為鑒別中藥的真偽及品質提供了新思路。