張家口地區甲癬病原真菌分布及藥物敏感性試驗研究*

吳遠慧，馮冬梅，王世寧，陳雷剛，楊曉靜

（河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000）

甲癬是臨床較常見的皮膚科淺表真菌疾病，致病菌主要包括皮膚癬菌、酵母菌、霉菌等［1］，疾病進展緩慢，病程反復［2］。隨著疾病的進展，可累及患者的甲板及甲下組織，給患者的生理、心理造成一定影響。有研究報道，甲癬地域性差異顯著［3］。及時、有效分析甲癬病原真菌的分布及藥物敏感性，對于指導臨床用藥具有顯著意義。通常，溫暖潮濕的環境適宜真菌生長［4］。但張家口地區的氣候寒冷干燥，僅夏季為淺部真菌病高發季節，真菌性皮膚病的菌種分布可能與氣候濕熱地區有所不同，且國內一直缺乏張家口地區淺部真菌病病原菌檢測及藥物敏感性試驗（簡稱藥敏試驗）分析相關的研究資料［5］。為此，本研究中分析了張家口地區甲癬病原真菌的培養鑒定及藥敏試驗結果，為臨床治療提供科學依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：確診為甲癬；符合淺部真菌病（手足癬、體癬、股癬、甲真菌病）的臨床表現，實驗性真菌鏡檢陽性。所有患者在張家口地區的分布性較均一。

排除標準：合并糖尿病、惡性腫瘤等慢性消耗性疾病；經過抗真菌治療。

病例選擇：采用描述性研究，選取我院2019年3月1日至2021年3月31日診治的甲癬患者512例。其中，男255例，女257例；年齡10～66歲，平均（33.26±2.59）歲；體質量指數（24.55±2.65）kg/m2；病程（3.12±1.02）年；病灶部位的臨床癥狀主要包括甲板內型、白色表淺型、全甲毀損型、近端甲下型、遠端側位甲下型等。

1.2 研究方法

甲癬病原真菌培養與鑒定：取患者的皮屑，分別進行直接鏡檢和真菌培養。直接鏡檢采取氫氧化鉀玻片法，以查到菌絲結構為陽性結果。傳統的真菌培養及鑒定方法為，取標本接種于含5×10-4g/L氯霉素的沙保弱瓊脂培養基斜面，置25～27 ℃恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）內培養，觀察菌落生長情況，第4 周未生長者視為培養陰性。培養陽性者應用馬鈴薯瓊脂培養基、玉米瓊脂培養基、察氏培養基及尿素瓊脂培養基行真菌分離培養與鑒定。根據菌落的大小、形態、生長速度、色素和質地，以及鏡下菌絲、孢子的形態特征鑒定菌種。必要時做玻片小培養，結合鏡下菌絲、孢子的形態和位置進行鑒定。在超凈臺上挑取和轉種真菌，顯微鏡下觀察，用棉藍對挑取的菌落染色。記錄菌種鑒定結果。

采用新興的真菌核糖體DNA（rDNA）基因間隔序列（ITS）測定技術進一步確定致病真菌類型。1）真菌DNA 的提取：分別收集培養于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上的真菌組織約100 mg，按照DNeasy Plant Mini Kit說明書提取菌株DNA，并利用E.Z.N.A.Micro Elute DNA CleanUp Kit 進行基因組DNA 純化。所有操作按試劑盒說明書進行，測量其濃度及純度。2）聚合酶鏈式反應- 高分辨熔解曲線分析技術（PCR - HRM）分型鑒定：于生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，得出菌種鑒定結果，并與傳統的真菌培養與鑒定方法進行比較，判斷結果是否一致。

藥敏試驗：采用抗真菌藥物紙片（杭州微生物試劑有限公司，批號為20181223）進行藥敏試驗，選取張家口地區常用藥物克霉唑、咪康唑、氟康唑、灰黃霉素、兩性霉素、特比萘芬等。分別挑取菌落于1 mL 蒸餾水中，以獲得菌絲和分生孢子的混合菌液，沉淀30 min；均勻涂布Mueller Hinton（MH）瓊脂（英國Oxoid 公司，批號為20280930）平板；待平板干燥，將其置28 ℃溫度下培養5～10 d。當平板生長時，測定抑菌環，得到藥敏試驗結果。分別對上述藥物的耐藥情況進行比較。

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件分析。計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 真菌培養與鑒定結果

經過菌群培養與鑒定，共培養陽性菌群患者366例，檢出病原菌366株，主要檢出紅色毛癬菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮狀表皮癬菌。詳見表1。

表1 真菌培養與鑒定結果（n=366）Tab.1 Results of fungal culture and identification（n=366）

2.2 患者性別分布

犬小孢子菌、鐵銹色小孢子菌以男性患者為主，青霉菌、念珠菌以女性患者為主。詳見表2。

表2 真菌培養與鑒定結果患者性別分布（例）Tab.2 Results of fungal culture and identification of patients with different genders（case）

2.3 患者年齡分布

患者主要以31～40歲的感染人群為主。詳見表3。

表3 真菌培養與鑒定結果患者年齡分布（例）Tab.3 Results of fungal culture and identification of patients with different ages（case）

2.4 陽性菌群患者藥敏試驗結果比較

藥敏試驗結果分析顯示，陽性菌群患者對克霉唑及咪康唑的耐藥率均在20%以上。詳見表4。

表4 藥敏試驗結果（n=366）Tab.4 Results of drug susceptibility test（n=366）

3 討論

流行病學調查顯示，由甲真菌病造成的指甲疾病的發病率為15%～40%［6］。英國的甲真菌的發病率為3%，疾病的形成碼顯示，30%的患者多與足癬疾病顯著相關［7］。老年人及男性患者的發病率顯著高于其他人群［8］。同時，甲真菌病存在顯著地域性及種族性差異［9］。英國一項調查顯示，85%～90%的甲真菌病是由皮膚癬造成，而其他疾病則是由非皮膚癬菌疾病造成［10］。既往研究顯示，造成甲真菌病的致病菌主要包括紅色毛癬菌及須癬毛癬菌，而這類致病菌的感染多見于親動物性的皮膚感染。而遺傳學研究認為，甲真菌病的易感性具有顯著遺傳學基礎，須癬毛癬菌及紅色毛癬菌具有顯著的家族遺傳性［11］。傳統的真菌鑒定方法為真菌培養后根據菌種的顯微鏡下形態進行鑒別，以其形態學、細胞學、生理學和生態學的特征為依據，簡單、易行、直觀，不需要昂貴的儀器，但在基層醫療機構仍未普及［12］，導致真菌性皮膚病的診斷主要是通過臨床經驗，常被誤診，且缺乏藥敏試驗，導致臨床用藥混亂，治愈率低。

本研究中，共培養陽性菌群患者366例，其陽性檢出率在70%以上，與既往研究結果［13］一致。而在對陽性菌群患者的研究中，主要以紅色毛癬菌、犬小孢子菌、念珠菌及絮狀表皮癬菌為主，提示張家口地區的真菌感染主要以上述病原微生物為主。張蕊娜等［14］的研究顯示，不管是老年人群，還是非老年人群，甲真菌病患者的主要致病菌均主要為紅色毛癬菌。鄭文愛等［15］對351株甲真菌病病原菌進行了體外藥敏試驗，結果紅色毛癬菌和指（趾）間毛癬菌對特比萘芬的最低抑菌濃度幾何均數最低。本研究中，張家口地區對兩性霉素及特比萘芬的耐藥情況顯著降低，提示臨床治療首選兩性霉素和特比萘芬，與鄭文愛等［15］、楊虹霞［16］的研究結果較一致。不同性別、年齡患者的致病菌的感染情況呈顯著差異，提示在治療中應根據患者的年齡、性別調整治療方式。

臨床皮膚科門診真菌性皮膚病病種多，病情復雜，并可能同時合并細菌或繼發其他微生物感染，臨床用藥復雜多樣，多有耐藥現象，為治療真菌性皮膚病帶來了難度，易延誤患者的治療，導致病情反復不愈［17］。尤其是基層醫療機構缺乏真菌鏡檢、培養及鑒定技術，且傳統的真菌鑒定方法在一定程度上受人為因素的干擾較大。本研究中，通過對患者的致病菌的核酸檢測，并進一步核對致病微生物，提高了本研究結果的準確性［18］。

綜上所述，張家口地區甲癬病原真菌以犬小孢子菌及紅色毛癬菌為主，對兩性霉素、特比萘芬的耐藥性較低。臨床需加強甲癬病原菌的檢測與鑒別，選擇治療藥物時可選擇耐藥性較低者，提高治療效率。