平喘止咳方治療慢性阻塞性肺疾病的網絡藥理學與分子對接研究*

黃柏文，朱宇敏，胡 珀，祝 穎，李 萍

（1. 江蘇省南京市中西醫結合醫院呼吸科，江蘇 南京 210014； 2. 南通大學附屬醫院中醫科，江蘇 南通 226000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的主要特征為持續的呼吸道癥狀及不完全可逆的氣流受限［1］，其患病率隨年齡的增長而升高［2］。西藥對癥治療COPD 起效較快，但停藥后易復發，且副作用大，嚴重影響患者的生存質量。中醫辨證施治可提高患者的免疫力，改善肺通氣，并可輔助西藥治療，達到減毒增效目的［3-4］。平喘止咳方由桑葉、黃芩、百部等中藥組方，具有清肺平喘、止咳化痰功效。在常規西藥治療基礎上應用平喘止咳方，可有效改善患者的膈肌功能，緩解呼吸肌疲勞，進而提高COPD 的療效［5］。網絡藥理學具有多成分、多靶點及多通路的特點，與中醫藥整體觀、辨證論治的原則相符［6］。本研究中基于網絡藥理學和分子對接技術，通過構建中藥復方調控網絡，系統分析并預測平喘止咳方治療COPD 的活性成分、作用靶點及相關通路，探討藥物與機體的相互作用，揭示其潛在作用機制，為平喘止咳方的臨床研究提供理論基礎?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

本研究中所用數據庫信息見表1。

表1 數據庫信息Tab.1 Information of databases

1.2 方法

平喘止咳方的相關成分及靶點獲?。和ㄟ^TCMSP數據庫，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18［7］為篩選條件，檢索平喘止咳方中桑葉、黃芩、百部、北沙參、陳皮、紫菀、款冬花、麻黃、桔梗、半夏、苦杏仁、木香、甘草的活性成分及作用靶點，借助Uniprot數據庫對作用靶點進行標準化處理。

COPD 靶點篩選：以“Chronic obstructive pulmonary disease”為關鍵詞，在GeneCards，OMIM，DisGeNET 數據庫中分別檢索COPD 的潛在靶點，合并各個數據庫的靶點，并刪除重復項，即得疾病相關靶點。

平喘止咳方治療COPD 靶點篩選：將上述COPD靶點及平喘止咳方靶點導入Venn 2.0.2數據庫，進行匹配映射，獲取平喘止咳方和COPD 的共有靶點，即平喘止咳方治療COPD的靶點。

活性成分- 共有靶點網絡構建：將上述平喘止咳方的活性成分與共有靶點導入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構建平喘止咳方活性成分-共有靶點網絡，并進行網絡拓撲參數分析，最后通過度值篩選核心成分。度值越大，該成分在治療COPD過程中越關鍵。

治療COPD 核心靶點的網絡構建及網絡拓撲學分析：將平喘止咳方活性成分與COPD 的共有靶點輸入String 數據庫，物種設置為“智人”種，最小交互分值設為0.7，構建蛋白互作網絡（PPI），再將結果以“TSV”格式導入Cytoscape 3.8.0 軟件中進行網絡拓撲參數分析，度值排名靠前的共有靶點即為核心靶點［8］。

共有靶點GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析：將平喘止咳方活性成分與COPD 的共有靶點導入DAVID 數據庫，物種設置為“智人”種，選擇GO 功能富集分析項下的生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞組成（CC）三部分及KEGG 通路部分進行富集分析。設定P＜0.05為富集分析結果顯著，采用R 語言選擇排序靠前的結果作圖分析。

分子對接驗證：采用Autodock Vina 軟件對核心成分與核心靶點進行分子對接，借助Pymol 軟件作圖。以最低結合能評價結合分子對接的好壞，結合能越低，表明對接結果越好。本研究中以結合能≤-5 kJ/mol 為相互作用較好［9］。

2 結果

2.1 平喘止咳方的活性成分靶點

在TCMSP數據庫中，共篩選OB ≥30%和DL ≥0.18的活性成分253個，其中甘草92個，黃芩36個，桔梗7 個，苦杏仁19 個，款冬花22 個，麻黃23 個，木香6 個，桑葉29 個，紫菀19 個，刪除重復項后得到216 個活性成分。得到相關成分靶點5 895 個，借助Uniprot 數據庫進行校正，刪除重復項后得到286個活性成分靶點。

2.2 平喘止咳方治療COPD 的靶點

從GeneCards，OMIM，DisGeNET數據庫中分別得到COPD靶點478個、147個、23個，刪除重復項后得到586個COPD靶點。與2.1項下活性成分靶點取交集，得到89個共有靶點，即為平喘止咳方治療COPD 的靶點。詳見圖1。

圖1 平喘止咳方活性成分靶點與COPD靶點的維恩圖Fig.1 Venn diagram of the targets of active components in Pingchuan Zhike Decoction and targets of COPD

2.3 平喘止咳方的活性成分-共有靶點網絡

將得到的216 個活性成分與89 個共有靶點導入Cytoscape 軟件中，構建平喘止咳方活性成分- 共有靶點網絡，詳見圖2。網絡中有284 個節點，1 039 條邊。根據度值篩選得到槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-胡蘿卜素、漢黃芩素、黃芩素等核心成分。

圖2 平喘止咳方活性成分-共有靶點網絡圖Fig.2 Network diagram of active components - common targets

2.4 治療COPD 核心靶點的PPI

將平喘止咳方與COPD 的共有靶點導入String數據庫中，獲得PPI，詳見圖3。并采用Cytoscape 3.8.0 軟件進行分析，根據度值進行篩選，得到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細胞介素6（IL-6）、信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）、水孔蛋白5（AQP5）、解整合素金屬蛋白酶8（ADAM8）、黏蛋白5AC（MUC5AC）等核心靶點。

圖3 治療COPD核心靶點的PPIFig.3 PPI of core targets in the treatment of COPD

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析結果顯示，得到生物過程2 132條，主要涉及對脂多糖、對細菌來源分子的反應，以及細胞對化學應激的反應等；得到細胞組成84條，包括膜筏、膜微區、膜區等；得到分子功能143 條，包括內肽酶活性、蛋白磷酸酶結合、絲氨酸型肽酶活性等。根據P值分別選取GO 功能富集分析條目排名前10 的結果繪制條形圖，詳見圖4。KEGG 通路富集分析得到155 條信號通路，主要涉及磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT、腫瘤壞死因子（TNF）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、白細胞介素17（IL-17）、缺氧誘導因子1（HIF-1）等，根據P值選取排名前20的結果繪制氣泡圖，詳見圖5。

圖4 GO功能富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of GO function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對接驗證

采用Autoduck Vina 軟件進行分子對接驗證，結果核心成分和核心靶點對接能量全部＜-5 kJ/mol，對接結果良好，驗證了網絡藥理學預測的準確性（圖6 A）。對接結果顯示，STAT3 和quercetin、AQP5 和kaempferol 的對接能量最小，其結合模式見圖6 B和圖6 C。

3 討論

COPD 屬中醫“肺脹”“喘證”范疇，本虛標實是其主要病理機制，以肺、腎、心、脾臟氣虧虛為本，痰濁、水飲、血瘀互結為標，治宜扶正與祛邪兼顧［10］。平喘止咳方由桑葉、黃芩、百部等中藥組方，具有化痰、理氣、通氣功效。臨床研究表明，該方治療COPD 急性加重期92例，有效率為93.48%，可提高COPD 患者的肺功能及血氣指標水平［5］。但中藥成分的復雜性，其治療COPD 的分子機制尚不明確。

本研究中通過網絡藥理學方法對平喘止咳方治療COPD 的作用機制進行了較全面地分析?；钚猿煞?共有靶點網絡分析發現，槲皮素、山柰酚、木犀草素等為核心成分。魏萍等［11］研究發現，槲皮素能降低轉化生長因子β1（TGF - β1）、α - 平滑肌肌動蛋白（α - SMA）、TNF-α 等的表達水平，緩解大鼠的肺組織炎癥和纖維化損傷。山柰酚可降低炎性因子TNF - α 等的表達水平，減少炎性細胞聚集，抑制炎性反應［12］。木犀草素具有抗纖維化、抑制炎性反應、調節免疫等作用，可顯著降低COPD 患者體內血清TNF-α 水平，使肺功能指標如最大通氣量、呼氣峰流速等得到明顯改善［13］。

A. 核心成分與核心靶點分子對接熱圖 B.STAT3和quercetin對接模式圖 C.AQP5和kaempferol對接模式圖圖6 分子對接圖A.Heat map of molecular docking of core components and core targets B.Docking mode diagram of STAT3 and quercetin C.Docking mode diagram of AQP5 and kaempferolFig.6 Diagrams of molecular docking

PPI 及KEGG 通路富集分析發現，AKT1，IL - 6，STAT3，AQP5，ADAM8，MUC5AC為核心靶點，主要調控PI3K/AKT，TNF，MAPK，IL - 17，HIF - 1 等信號通路，從而發揮治療COPD 的作用。AKT 可由活化的PI3K 募集而活化，進而廣泛參與細胞自噬、增殖、凋亡等生物調控［14］。通過下調PI3K 和AKT1 基因表達、上調mTOR基因表達，減輕COPD 模型大鼠肺組織炎性細胞的浸潤及纖維組織增生，從而緩解肺組織損傷，起到抗COPD的 作 用［15］。PI3K/ AKT/ 哺 乳 動 物 雷 帕 素 靶 蛋 白（mTOR）通路為細胞內的基本信號轉導途徑，上調PI3K/ AKT/ mTOR 的表達可使呼吸道平滑肌細胞增殖、遷移及黏附，并使細胞外基質成分積累，導致氣道壁增厚而發生COPD［16］。MAPK是細胞中的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括胞外信號調節激酶（ERK）、c-Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）、p38。當JNK 及p38 被激活時，可修復氣道上皮細胞及促進黏蛋白MUC5AC 的表達［17］。STAT為JAK激酶（JAK）的下游基因，共同組成的JAK/ STAT 信號通路在細胞增殖及凋亡中至關重要。通過促進JAK，STAT3 等磷酸化，進而上調JAK/STAT 的表達，可引發炎性反應，促進COPD 肺血管重塑［18］。輔助性T 細胞17（Th17）及其特異性細胞因子參與介導COPD產生及進展過程中的多個環節，尤以IL-6，IL-17A，TNF-α 等對肺局部的炎癥、自噬、纖維化等發揮重要作用，因IL - 6，IL - 17A，TNF - α 等各類特異性細胞因子的異常高表達而推進了COPD 的進程［19］。HIF-1α 可上調一氧化氮合酶基因，參與肺血管的重塑，進一步參與COPD 的發生與發展［20］。本研究結果表明，平喘止咳方可能通過槲皮素、山柰酚、木犀草素等主要活性成分作用于AKT1，IL- 6，STAT3 等相關靶點，從而調控PI3K/AKT，TNF，MAPK 等信號通路而發揮治療COPD的作用。

綜上所述，本研究中采用網絡藥理學和分子對接技術初步揭示了平喘止咳方通過多成分、多靶點、多通路治療COPD 的分子機制。但因數據庫更新不及時、收錄不全等原因，僅單純通過數據庫及網絡模型預測，無法完全評價平喘止咳方在體內的具體代謝過程，需后續實驗進一步驗證。