不同省份小果沙棘葉中黃酮類化合物含量測定及體外抗氧化能力評價

高國燕，蔣林樹，年 芳，王 慧*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營養(yǎng)學(xué)北京市重點實驗室，北京 102206）

沙 棘（Hippophae RhamnoidesL.，Sea Buckthorn）又名醋柳、黑刺、酸刺，是胡頹子科沙棘屬落葉灌木，主要多分布于我國西北、華北、西南等干旱地區(qū)，是一種藥食同源植物，富含蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、糖類、類胡蘿卜素、甾醇、揮發(fā)油、黃酮、多酚、有機酸及微量元素等多種營養(yǎng)成分和功能活性成分（寧志雪等，2021）。據(jù)報道，沙棘中的主要功效活性成分為黃酮類化合物，由異鼠李素、山奈酚、槲皮素、蘆丁等苷元構(gòu)成，黃酮類化合物具有較強的抗病毒、抗氧化、增強機體免疫力等功能。活性氧自由基過量會造成機體脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA 等生物大分子的損傷，同時ROS 作為信號分子參與多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)細胞分化、細胞凋亡、炎癥或免疫反應(yīng)等（盧德勛，2021）。而黃酮類化合物能清除機體生理和非生理自由基，發(fā)揮抗氧化作用（De Oliveira 等，2020）。

因采摘時間、采集部位、產(chǎn)地及品種的不同，沙棘的主要活性成分及抗氧化能力也存在一定的差異（楊嵐等，2018 ；Ma 等，2016）。因此，本試驗對我國不同省份種植的野生型小果沙棘葉片中的黃酮含量及抗氧化能力進行測定和評價，旨在為沙棘黃酮在緩解畜禽氧化應(yīng)激中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究所用的沙棘葉于2019 年6 月分別采自新疆清河縣（編號：XJ）、內(nèi)蒙蠻汗山（編號：NM）、甘肅定西（編號：GS）、山西交城縣（編號：SX）、遼寧建平（編號：LN）。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘葉中黃酮粗提物的制備和總黃酮含量測定 將小果沙棘葉片除雜干燥后粉碎，過40 目篩。石油醚脫脂后的沙棘粉末以1 ：35 g/mL 的比例各加入70% 乙醇溶液進行超聲提取，每個樣品超聲3 次，每次超聲為30 min。經(jīng)冷凍干燥后獲得小果沙棘葉總黃酮粗提物粉末。黃酮含量按照NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 比色法測定（潘予琮，2021）。蘆丁標準曲線的線性回歸方程為：y=6.2758x+0.0387，R2=0.9995。

1.2.2 小果沙棘葉總黃酮中4 種黃酮類化合物的含量測定 槲皮素、蘆丁、山奈酚、異鼠李素標準品及小果沙棘葉總黃酮粗提物粉末用甲醇溶解，0.22 μm 濾膜過濾備用。采用安捷倫1260型液相色譜儀用于高效液相色譜分析。色譜柱為Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動相選擇乙腈（A）-0.5 % 磷酸溶液（B）；梯度洗脫（0 ～15 min，15% ～20% B；15 ～20 min，20% ～20% B ；20 ～55min，20% ～35% B ；55 ～60 min，35% ～85% B ；60 ～90 min，85%B）；流速1.0 mL/min ；檢測波長350 nm；柱溫25℃；進樣量10 μL。

1.2.3 小果沙棘葉總黃酮抗氧化能力測定

1.2.3.1 小果沙棘葉總黃酮對DPPH? 清除能力

參考孫朦等（2018）方法，準確吸取不同濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的小果沙棘葉總黃酮溶液各2.0 mL，加入等體積的0.2 mmol/L的DPPH? 溶液，充分振蕩混勻后避光放置30 min，在517 nm 處測定吸光度值，每個樣品進行3 次重復(fù)。VC作陽性對照。

式中：A0 為2 mL DPPH 溶液和2 mL 無水乙醇的吸光度值；A1 為 2mL 樣品溶液和2 mL無水乙醇的吸光度值；A2 為2 mL DPPH 溶液和2 mL 樣品溶液的吸光度值。

1.2.3.2 小果沙棘葉總黃酮對ABTS＋?清除能力測定 參考付曉丹等（2015）方法，將7.4 mmol/L ABTS＋? 溶液與2.45 mmol/L K2S2O8溶液等比例混合，室溫避光放置14 h 即得ABTS＋? 儲備溶液。將ABTS＋? 儲 備 溶 液 用pH=4.5 的NaAc-HAC 緩沖液稀釋，使其OD734在0.7±0.02 時即為適宜的ABTS＋? 工作液濃度。在試管中依次加入總黃酮溶液0.2 mL、ABTS＋? 工作液0.3 mL，40% 乙醇溶液0.5 mL，充分振蕩混勻后避光放置10 min，在734 nm 處測定吸光度值。以無水乙醇代替樣品溶液為空白組吸光度值。

式中：A1 為樣品測定吸光度值；A0 為空白對照吸光度值。

1.2.3.3 小果沙棘葉總黃酮對O2-?清除能力測定參考Wang 等（2018）方法，在試管中依次加入pH 8.2 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液4.5 mL、總黃酮溶液0.1 mL，混勻置于25℃水浴鍋中預(yù)熱20 min，后加入25℃提前預(yù)熱的3 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻后于25℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，加 入2 滴8 mol/L HCl 終 止 反 應(yīng)，在320 nm 處測定吸光度值；以蒸餾水取代黃酮溶液為空白對照組；以蒸餾水取代鄰苯三酚為樣品溶液的本地吸光度值。VC作為陽性對照。

參考Wang 等（2018）的方法改進，在試管中依次加入pH 8.2 的0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液4.5 mL，置于25 ℃水浴鍋中預(yù)熱20 min，后加入總黃酮溶液0.1 mL 和25 ℃提前預(yù)熱的3 mmol/L 的鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻后于25℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，加入2 滴8 mol/L HCl 終止反應(yīng)，在320 nm 處測定吸光度值；以蒸餾水取代黃酮溶液為空白對照組；以蒸餾水取代鄰苯三酚為樣品溶液的本地吸光度值。VC作為陽性對照。

式中：A2為樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液的本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.2.3.4 小果沙棘葉總黃酮還原能力的測定 參考陳紅梅等（2016）方法，在試管中依次加入總黃酮溶液、pH 6.6 磷酸鹽緩沖溶液和1% 的鐵氰化鉀溶液各1.5 mL，搖勻后于50℃水浴20 min，取出冷卻后加入10% 三氯乙酸溶液1 mL，振蕩均勻，4000 r/min 離心15 min。取上清液1 mL，加蒸餾水2 mL 和0.1% FeCl3溶液1 mL，混勻靜置5 min，在700 nm 波長下測定吸光度值。以蒸餾水代替不同濃度小果沙棘葉總黃酮為空白對照組。

還原力吸光度值OD700= 樣品吸光度值OD700- 空白對照吸光度值OD700。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用WPS Office Excel初步統(tǒng)計、作圖，采用SPSS 20.0 進行Pearson’s相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 不同省份小果沙棘葉總黃酮和4 種黃酮類化合物含量測定 5 個省份小果沙棘葉片中總黃酮含量為1.23% ～4.68%，依次為甘肅GS（4.68%）、山西SX（3.54%）、內(nèi)蒙NM（2.85%）、新疆XJ（1.94%）、遼寧LN（1.23%）。由圖1 可知，不同省份小果沙棘葉的4 種黃酮類化合物中，異鼠李素和槲皮素在5 省份小果沙棘葉中所占比例均相對較高；山奈酚所占比例相對較低；蘆丁在新疆XJ 和遼寧LN 小果沙棘葉中所占比例較高。

圖1 不同省份小果沙棘葉中4 種黃酮類化合物含量占比

2.2 不同省份小果沙棘葉總黃酮抗氧化能力測定

2.2.1 不同省份小果沙棘葉總黃酮對DPPH?清除能力 由圖2 可知，在測定濃度范圍內(nèi)（0.1 ～1 mg/mL），5 個省份小果沙棘葉總黃酮對DPPH? 的清除率呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系，且清除率隨黃酮濃度的增加而逐漸升高。總體看，5 個省份小果沙棘葉總黃酮對DPPH? 清除率高低依次為甘肅GS ＞山西SX ＞內(nèi)蒙NM ＞新疆XJ ＞遼寧LN。

圖2 不同省份小果沙棘葉總黃酮對DPPH?的清除能力

2.2.2 不同省份小果沙棘葉總黃酮對ABTS+? 清除率 由圖3 可知，5 個省份小果沙棘葉中總黃酮對ABTS+?的清除率隨添加濃度的增加而升高，表明其清除能力與添加濃度遵循量- 效應(yīng)關(guān)系。當黃酮濃度為1 mg/mL 時，5 個省份小果沙棘葉中總黃酮對ABTS+? 清除率值為30.8% ～46.5%，清除效率最高的是內(nèi)蒙NM 小果沙棘葉總黃酮（46.5%），清除效率最低的是甘肅GS 小果沙棘葉總黃酮（30.8%），此濃度下VC對ABTS+? 清除率為41.1%。

圖3 不同省份小果沙棘葉總黃酮對ABTS+?的清除能力

圖4 不同省份小果沙棘葉總黃酮對O2-?的清除能力

2.2.4 不同省份小果沙棘葉總黃酮還原能力 由圖5 可知，在測定濃度范圍內(nèi)（0.1 ～1 mg/mL），5個省份小果沙棘葉中總黃酮還原力均不如VC，但隨著小果沙棘葉總黃酮質(zhì)量濃度的升高，吸光度值逐漸增大，表明抗氧化能力逐步增強。當濃度為0.1 ～0.6 mg/mL 時，甘肅GS 小果沙棘葉總黃酮還原力從0.084 提高到0.762，其在1 mg/mL 時的還原力可達到同等濃度VC還原力的76.9%，表現(xiàn)出較好的抗氧化能力。

圖5 不同省份小果沙棘葉總黃酮還原能力

2.4 不同省份小果沙棘葉總黃酮抗氧化力的IC50（EC50）值 由表1 可知，不同省份小果沙棘葉總黃酮和陽性對照VC對DPPH? 清除力的IC50值大小依次為VC＜GS ＜SX ＜NM ＜XJ ＜LN；ABTS+? 清 除 力 的IC50值 大 小 依 次 為VC＜SX＜GS ＜LN ＜NM ＜XJ；O2-? 清除力的IC50值大小依次為SX ＜XJ ＜NM ＜VC＜LN ＜GS ；還原力的EC50值大小依次為VC＜GS ＜SX ＜NM＜XJ ＜LN。綜合分析可知，山西SX 和甘肅GS較其他小果沙棘葉總黃酮抗氧化能力強。

表1 不同省份小果沙棘葉總黃酮抗氧化力的IC50（還原力，EC50）值 mg/mL

2.5 小果沙棘葉各黃酮含量與抗氧化能力的IC50（EC50）相關(guān)性分析 由Pearson’s 相關(guān)性結(jié)果可知，小果沙棘葉總黃酮含量與還原力的EC50值呈極顯著負相關(guān)（P ＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.978 ；異鼠李素與DPPH? 清除力的 IC50 值、還原力的EC50值呈顯著（P ＜0.05）負相關(guān)；山奈酚與DPPH? 清除力的 IC50 值、還原力的EC50值呈顯著（P ＜0.05）正相關(guān)；蘆丁與ABTS+? 清除力的IC50 值呈顯著（P ＜0.05）正相關(guān)；槲皮素與所有檢測的抗氧化指標的IC50值相關(guān)性均不顯著（P ＞0.05）。

表2 小果沙棘葉黃酮含量與抗氧化力IC50（還原力，EC50）相關(guān)性分析

3 討論

3.1 不同省份小果沙棘葉總黃酮與4 種黃酮類化合物含量比較 沙棘中的黃酮含量和主成分因不同產(chǎn)地、不同品種、采摘時間而產(chǎn)生明顯的差異。四川產(chǎn)沙棘總黃酮含量為73.9%，明顯高于北京產(chǎn)沙棘（20.1%），西藏沙棘、江孜沙棘的總黃酮含量明顯高于中國沙棘，而且西藏沙棘中黃酮化合物蘆丁含量最高為1976.7 μg/g。中國沙棘6 ～8 月總黃酮的含量最高，且雌株葉高于雄株葉。也有研究表明，沙棘不同采摘部位其黃酮含量也有所差別，沙棘葉黃酮含量最高（Raffo 等，2004）。

本試驗對沙棘中較常見的4 種黃酮類化合物含量進行測定，其均具有多種生物活性，如抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用。付桂香等（1997）與本研究一致表明，新疆XJ 沙棘葉片中蘆丁含量最高，通過分析不同國家種植的多個沙棘栽培品種發(fā)現(xiàn)，沙棘中主要的黃酮苷元為槲皮素、山奈酚和異鼠李素，其含量分別為3 ～100、2 ～16 和350 ～660 mg/kg ；異鼠李素含量明顯高于槲皮素、山奈酚，沙棘果肉黃酮中異鼠李素含量最多，沙棘籽黃酮則是山奈酚含量最多（Di 等，2020），這也從側(cè)面說明本文不同省份小果沙棘葉中黃酮主成分含量不同的原因可能是沙棘產(chǎn)地的氣候差異、生態(tài)土壤環(huán)境差異導(dǎo)致其產(chǎn)量和品質(zhì)上的差異，進而導(dǎo)致黃酮含量不同，但其富集機制仍有待進一步研究。

3.2 不同省份小果沙棘葉中各黃酮含量與抗氧化能力相關(guān)性 自由基易與細胞膜磷脂中多不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵發(fā)生反應(yīng)，造成細胞膜破壞，進而引發(fā)細胞脂質(zhì)氧化損傷，導(dǎo)致機體免疫功能失調(diào)，引發(fā)各種疾病（盧德勛，2021）。黃酮類化合物通過抑制、清除自由基和激活機體抗氧化體系而發(fā)揮抗氧化作用。本研究表明，在DPPH?、ABTS+?、O2-?、還原力體系中，5 種小果沙棘葉總黃酮均可有效清除生理和非生理自由基，但就不同省份小果沙棘葉中總黃酮的IC50 值來說，山西SX 和甘肅GS 的沙棘葉總黃酮比其他省的抗氧化能力強，與二者總黃酮含量高有關(guān)（付依依等，2021）。大量研究表明，植物活性成分的抗氧化能力與黃酮含量具有一定相關(guān)性。陳玉霞等（2007）比較了常見的25 種蔬菜中維生素C、總多酚、總類黃酮的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與總多酚和總黃酮含量之間相關(guān)性較大；康超等（2021）研究表明，不同品種芒果黃酮化合物含量與抗氧化能力具有量效關(guān)系，且不同來源、產(chǎn)地的沙棘總黃酮抗氧化能力有所差異。

本試驗相關(guān)性結(jié)果表明，小果沙棘葉總黃酮與還原力的EC50值呈顯著負相關(guān)，與其他抗氧化評價體系不顯著，這可能是不同物質(zhì)在不同抗氧化評價體系中發(fā)揮的抗氧化原理不同（Gulcin等，2020）。異鼠李素含量與還原能力的EC50值、DPPH? 的IC50值呈顯著負相關(guān)，說明小果沙棘葉總黃酮中異鼠李素含量越高抗氧化能力越強；異鼠李素通過PI3K/AKT/PKB，NF-κB，MAPK 信號通路及相關(guān)細胞因子和激酶的表達起到抗炎、抗氧化作用（Gong 等，2020）。王苗苗等（2020）對兩種新疆沙棘中黃酮體外抗氧化的研究中同樣說明沙棘黃酮中異鼠李素的含量越高抗氧化能力越強；這與體內(nèi)抗氧化的結(jié)果相符合（周健等，2021）。山奈 酚 和 蘆丁含量與DPPH? 的IC50值、ABTS+? 的IC50呈相反趨勢，原因可能是DPPH·和ABTS+? 是非生理的體外抗氧化測定方法，有局限性；且自由基清除活性與酚羥基的位置和酚羥基上H 原子的電荷分布有關(guān)。山奈酚和蘆丁抗氧化性能可能是通過清除生理性的O2-?發(fā)揮抗氧化作用（Gulcin 等，2020）。本研究證明，沙棘小果葉總黃酮含量與抗氧化能力有密切關(guān)系，而沙棘小果葉總黃酮的作用機制及沙棘小果葉總黃酮中某種類黃酮化合物與抗氧化能力的關(guān)系有待進一步探索。

4 結(jié)論

不同省份小果沙棘葉總黃酮含量及其組成均存在差異，其中甘肅GS 小果沙棘葉總黃酮含量最高且抗氧化能力最強，山西SX 小果沙棘葉總黃酮次之。