白頭翁湯對人工感染雞大腸桿菌病的治療效果研究

呂顏枝，陳永亮，王善輝

（徐州生物工程職業技術學院，江蘇徐州 221006）

調查顯示，家禽腸道疾病是危害家禽養殖業的主要問題之一，可造成嚴重的經濟損失，其流行具有病原種類復雜，血清型多樣，毒力強、易變異，混合感染和繼發感染普遍等特點，其中以大腸桿菌為首（呂顏枝等，2020）。中獸醫認為，家禽大腸桿菌病屬于外感溫熱病，符合衛氣營血辨證，病邪依次進入衛分、氣分、營分和血分，由表及里、逐漸加重的發展趨勢，對該病辨證論治，確定治則以清熱解毒為主，以涼血止痢、清肝瀉火為輔（張丁華，2010）。方劑白頭翁湯（Pulsatilla Decoction，PD）以白頭翁為君藥，發揮清熱解毒、涼血止痢的功效，黃連、黃柏和秦皮是臣佐藥，發揮君藥發揮清熱解毒、燥濕治痢的功效（馬琪，2018）。PD 中的主要藥物成分包含香豆素類，生物堿類，檸檬苦素類和皂苷類等，能發揮抗菌、抗炎和修復潰瘍、免疫調節和抗腹瀉等藥理作用。王麗等（2020）、胡越等（2020）研究表明，PD 提取物可降低痢疾桿菌DNA 含量，能通過調控一些細胞因子等來治療潰瘍性結腸炎。楊雪貞等（2020）、馬俊萍（2020）、李文超等（2010）對PD 在家禽疾病治療方面的研究表明，禽巴氏桿菌對PD 高度敏感，PD 和白頭翁抗球蟲效果比較強，并對球蟲孢子化卵囊有一定的抑制作用。因此，本文在前期研究的基礎上（呂顏枝等，2021），對PD 的體內外抗雞大腸桿菌作用進行了相關試驗，為中藥在獸醫臨床中的使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料準備

1.1.1 菌液制備 菌株來源于課題組人員篩選出的大腸桿菌多重耐藥菌株，即O78、O157，對慶大霉素、四環素、增效磺胺、阿莫西林、鏈霉素等12種抗菌藥物存在耐藥性。純培養后，挑單個菌落于肉湯培養基中培養18 h，采取平板稀釋菌落計數法計算菌液含菌量，臨用前用滅菌胰蛋白胨大豆肉湯稀釋成1×105CFU/mL，冷藏保存。

1.1.2 藥液制備 白頭翁湯：白頭翁60 g、黃柏30 g、黃連45 g、秦皮60 g，采用研究證明最佳工藝提?。▍强麻?，2020），稱取處方量100 g，選取8 倍量60% 乙醇提取3 h，精確量取100 mL 甲醇- 水溶液，配制成濃度為1 g/mL 的溶液，用微孔膜過濾，取濾液冷藏保存。

1.1.3 試驗動物 蘆花雞，購自山東金秋農牧科技股份有限公司，300 只，70 日齡，公母各半，平均體重：公雞約1.3 kg，母雞約1.1 kg，普通飼料養殖，飼養1 周后確認無大腸桿菌病等異常癥狀方可用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 采用微量肉湯棋盤稀釋法測定PD 提取液對雞大腸桿菌的MIC 值，為避免藥液顏色和渾濁對結果的影響，將各濃度的培養液接種到普通營養瓊脂平板上，37℃培養24 h，觀察細菌生長情況來幫助判定。

1.2.2 測定大腸桿菌半數致死量（Median Lethal Dose，LD50） 將50 只雞隨機分為5 組，公母各半，分別經腹腔注射大腸桿菌菌液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，72 h 后統計雞只死亡情況，以確定引起半數死亡的最佳攻毒劑量。

1.2.3 人工感染試驗 將250 只雞隨機分為5組，公母各半，分別為高、中、低計量組、陽性對照組和健康對照組。除健康對照組外，其他組每只雞腹腔注射最佳攻毒劑量的大腸桿菌菌液0.3 mL。隨后觀察雞只癥狀并檢測病原，以確定是否由接種菌感染致死。

1.2.4 藥物治療試驗 試驗雞攻毒發病后，對治療組采用高（0.7 mL/ 只）、中（0.5 mL/ 只）、低（0.3 mL/ 只）3 個劑量進行治療，1 h 內飲完，每天1 次，連用5 d，停藥后觀察10 d；同時設陽性對照（感染、不給藥）和健康對照（不感染、不給藥）組。

1.2.5 治療效果判定及統計分析 各組藥物治療期間密切關注各組雞只的發病和恢復情況，其效果判定依據（李連缺等，2019）主要有臨床癥狀觀察、剖解病理變化等，判定其屬于未治愈、有效和無效。統計出治愈數、有效數和死亡數，并計算其相應的百分比。采用SPSS 21.0 軟件進行統計分析，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結果及分析

2.1 MIC 值測定結果 PD 對2 株大腸桿菌耐藥菌株的MIC 測定結果顯示，白頭翁湯對1、2 號菌株的MIC 值分別為0.125 g/mL 和0.250 g/mL，對1 號菌株抑菌力較強，平均MIC 值為0.187 g/mL，表明PD 對大腸桿菌有較強的抑菌效果。

2.2 菌株的LD50測定結果 按照1.2.2 的方法測定雞大腸桿菌的LD50是0.3 mL/ 只，確定為人工感染試驗最佳攻毒劑量。

2.3 人工感染試驗結果 攻毒7 h 后，雞只開始出現臨床癥狀，1 d 后逐漸出現死亡。主要表現為食欲減退或廢絕、翅膀下垂、拉黃白色稀糞等。剖檢可見肝周炎病變，肝臟腫大、充血出血、質地易碎、表面有一層纖維素性滲出物覆蓋；心包炎，心包腔中有大量纖維素性滲出物；腹腔臟器黏連，腹膜炎，腸黏膜腫脹、充血、出血，如圖1、圖2。從病變處均可分離出大腸桿菌，如圖3。

圖1 心包炎、肝周炎病變

圖2 腹膜炎、腸黏膜水腫病變

圖3 大腸桿菌（400 倍）

2.4 藥物治療試驗結果 高、中、低劑量組的病雞在用藥1 ～2 d 內死亡較多，3 d 后精神開始好轉，5 d 后逐漸恢復正常；陽性對照組在實驗期間大部分精神不振、少食或不食，陸續死亡，死亡率較高，加之意外死亡，最終死亡率高達51% ；健康對照組由于啄肛死亡1 只，其他一切正常。由表1 可知，中、低劑量組治愈率、死亡率無顯著差異（P ＞0.05），但在有效率、無效率上差異顯著（P ＜0.05），說明中劑量組有效率高；而高劑量組治愈率達96%、有效率達98%，死亡率控制在2%，明顯優于中、低劑量組的治療效果，且差異顯著（P ＜0.05）。陽性對照組與3 種劑量藥物治療組相比存在極顯著差異（P ＜0.01）。

表1 PD 對人工感染雞大腸桿菌病的治療結果%，μ=50

3 討論

武怡荷等（2021）、張瀚元（2018）研究表明，復方中藥可顯著降低雞大腸桿菌病發病率，提高雞大腸桿菌病治愈率及總有效率，而且高劑量組復方中藥的治療效果與復方阿莫西林克拉維酸相當，0.5 g/mL 復方中藥對雞大腸桿菌的病療效最佳，機理是其起抑菌作用的同時增強了雞紅細胞的免疫功能，且該復方中藥安全無毒。本試驗前期研究發現了PD 和黃連解毒湯對大腸桿菌病均有效，但體內、外抗菌效果不一致，體外抗菌作用直接，效果明顯，但體內抗菌機理復雜，藥物作用的發揮受機體內環境及其他微生物等因素影響（呂顏枝等，2021）。為了進一步研究PD 的體內外抗菌效果和機理，本試驗在測定方劑MIC 值和菌株LD50的基礎上進行了體內抗菌機理試驗，結果顯示，PD 可有效控制雞大腸桿菌病病死率。但中藥方劑組成復雜、成分多、靶點多，作用機理研究較難。付琳等（2021）、劉靜茹等（2020）、GUO等（2017）、LING 等（2016）通過現代藥理學研究發現，白頭翁主要含皂苷類成分，具有抗腫瘤、抗菌消炎、舒張血管等一系列藥理活性；黃連主要成分為物堿類、木脂素類、黃酮類等，具有抗腫瘤、降血糖、抗病原微生物、抗炎、改善消化系統等作用；黃柏主要成分是小檗堿、槲皮素、β- 谷甾醇對等，在降血壓糖、抗菌、抗癌等方面作用明顯；秦皮主要成分為香豆素類、木脂素類、裂環烯醚萜類、黃酮類等，具有抗菌、抗炎、抗氧化、利尿及抗腫瘤作用。PD 作為經典方劑，其藥理作用的發揮不是簡單的依靠4 味藥的化學成分簡單相加，而是各成分之間相互作用發揮效應，共奏清熱解毒、涼血止痢之功效。

4 結論

本試驗結果發現，PD 在雞大腸桿菌病的治療上有效率高，尤其是高劑量組抗菌作用最明顯，治愈率高達96%，但并不能證明劑量越高治療效果越好，其機理還需進一步研究。另外，該治愈率是針對人工感染試驗雞只的，屬于單一感染，雞只試驗期間沒有做相關的疫苗免疫，這些情況均會影響治療效果，因此，如果在養殖場自然感染的情況下，其治愈率可能會有變化。