Beclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其臨床意義

謝田鳳 楊進(jìn)瓊 陳秀芬

[摘要]目的探討B(tài)eclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白在子宮內(nèi)膜癌（EC）中的表達(dá)及其臨床意義。方法選取高州市人民醫(yī)院2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作為觀察組，選取同期高州市人民醫(yī)院58例子宮肌瘤患者作為對(duì)照組，兩組患者均進(jìn)行子宮切除術(shù)，獲取兩組病灶組織標(biāo)本，采用Westernblot法檢測(cè)并比較兩組患者病灶組織Beclin-1、Bax、CDK4蛋白相對(duì)表達(dá)量，分析Beclin-1、Bax、CDK4在不同病理特征EC患者中表達(dá)的差異情況。結(jié)果觀察組的CDK4表達(dá)水平高于對(duì)照組，觀察組的Bax及Beclin-1水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低、未分化程度、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者的CDK4表達(dá)水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～I(xiàn)I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)<1/2的患者，低、未分化程度、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者中Beclin-1及Bax表達(dá)水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～I(xiàn)I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)<1/2的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論EC患者病灶組織的Beclin-1、Bax及CDK4與子宮肌瘤患者存在明顯差異，Beclin-1、Bax及CDK4可作為評(píng)估EC患者預(yù)后的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]Beclin-1;Bax;周期蛋白依賴性激酶;子宮內(nèi)膜癌

[中圖分類號(hào)]R737.33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2022）11-0147-04

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是一種起源于子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤，目前研究顯示[1]，EC占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤患者總數(shù)的20%～30%，且發(fā)病率呈逐年上升及年輕化的趨勢(shì)，對(duì)我國(guó)女性生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前主要采用手術(shù)治療EC，但部分患者術(shù)后復(fù)發(fā)且復(fù)發(fā)患者生存期較短，對(duì)EC進(jìn)行早期診斷及干預(yù)具有重要意義。隨著分子醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，目前發(fā)現(xiàn)在EC患者中存在多種因子的異常表達(dá)，其中Beclin-1、Bax及周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinases，CDK4）屬于凋亡基因編碼蛋白家族成員[2]，通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、參與細(xì)胞自噬過(guò)程及腫瘤細(xì)胞凋亡抑制等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究中對(duì)EC患者的Beclin-1、Bax及CDK4的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其在子宮內(nèi)膜惡性腫瘤及良性腫瘤中的差異情況，同時(shí)分析其在惡性腫瘤患者中表達(dá)的差異情況，為臨床提供參考。

1資料與方法

1.1一般資料

選取高州市人民醫(yī)院（我院）2019年1月至2021年6月收治的42例EC患者作為觀察組，選取同期我院收治的58例子宮肌瘤患者作為對(duì)照組，觀察組年齡32～68歲，平均（47.6±3.5）歲;體重指數(shù)（body mass index，BMI）18.21～28.54kg/m2，平均（21.75±1.06）kg/m2;分化程度：低、未分化21例，中分化11例，高分化10例;病理分期：I～I(xiàn)I期35例，III～I(xiàn)V期7例，子宮內(nèi)膜厚度4～24mm，平均（16.21±2.35）mm。對(duì)照組年齡31～67歲，平均（47.2±3.0）歲;BMI17.52～29.56kg/m2，平均（21.60±1.04）kg/m2。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1經(jīng)我院影像科、病理科檢查，確診為EC或子宮肌瘤，其中子宮肌瘤患者子宮內(nèi)膜組織正常;2擬行腹腔鏡下子宮全切術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：1合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙者;2合并神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者;3入組前接受過(guò)放化療治療者。

1.2方法

留取兩組患者術(shù)中病灶組織送病理學(xué)檢查，加入RIPA裂解液后進(jìn)行充分勻漿，勻漿次數(shù)15次，勻漿時(shí)間為30min，獲取勻漿懸浮液，置于新型單溫區(qū)冷藏冷凍設(shè)備（北京福意電器有限公司，型號(hào)：FYL-YS-129A型），在4°C的條件下保存1h。使用離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司，型號(hào)：OptimaMAX-TL型）離心10min，離心速度為15000r/min，離心半徑為15cm，提取上清液，獲取總蛋白。行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印，先使用70V恒壓進(jìn)行分離膠后調(diào)至100V，使用濕轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移蛋白，使用280mA恒定電流轉(zhuǎn)模50min，脫脂奶粉（加入1×TBST10ml與0.5g脫脂牛奶干粉進(jìn)行震蕩充分溶解）進(jìn)行封閉，封閉條件：37°C，1h，而后使用PBST洗膜3次，10min/次;加入兔抗Bax（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）、羊抗Beclin-1（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）及兔抗Bax（稀釋濃度1∶1000，上海信裕生物科技有限公司），置于4°C保存箱，使用Fast Blocking Western封閉液（購(gòu)自翌圣生物科技公司）過(guò)夜孵育，而后使用PBST洗膜3次，10min/次。加入羊抗兔二抗（稀釋濃度1∶2000，上海信裕生物科技有限公司）置于室溫下進(jìn)行2h孵育，而后采用ECL顯色（顯色液以過(guò)氧化氫與魯米諾按1∶1比例配制）。條帶的光密度值采用ImageJ1.8.0軟件半定量進(jìn)行分析。目的蛋白的表達(dá)量=CDK4、Beclin-1及Bax與β-actin灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.3觀察指標(biāo)

1患者病灶組織CDK4、Beclin-1及Bax的相對(duì)表達(dá)量;2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料如CDK4、Beclin-1及Bax水平采用M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者病灶組織CDK4、Beclin-1及Bax的相對(duì)表達(dá)量的比較

觀察組CDK4表達(dá)水平高于對(duì)照組，觀察組Bax及Beclin-1水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2CDK4、Beclin-1及Bax在不同病理特征EC患者中的表達(dá)情況

低、未分化程度、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者的CDK4表達(dá)水平高于中、高分化程度、FIGO分期I～I(xiàn)I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)<1/2的患者;低、未分化程度、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者中Beclin-1及Bax表達(dá)水平低于中、高分化程度、FIGO分期I～I(xiàn)I期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)<1/2的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3討論

EC是常見女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其病死率較高，對(duì)女性生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前仍尚未完全闡明EC的發(fā)病機(jī)制，由于EC的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸涉及多種復(fù)雜因素，在探討預(yù)測(cè)EC患者預(yù)后指標(biāo)方面一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究[3-5]顯示，子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，其主要治療方法為手術(shù)治療，結(jié)合化療、放療、免疫療法等可改善患者預(yù)后。相關(guān)研究[6]證實(shí)，子宮內(nèi)膜由于血運(yùn)豐富，可為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。相關(guān)研究[7]顯示，子宮內(nèi)膜癌患者癌細(xì)胞增殖狀態(tài)對(duì)疾病發(fā)展產(chǎn)生重要作用，而病灶部位新生血管是細(xì)胞增殖狀態(tài)的基礎(chǔ)且受多種因子的調(diào)控，其中CDK4是調(diào)控子宮內(nèi)膜癌患者病灶部位新生血管的主要基因之一。

相關(guān)研究[8]顯示，CDK4能夠結(jié)合cyclinD1進(jìn)而形成促進(jìn)癌細(xì)胞周期改變的復(fù)合物，同時(shí)體外研究[9]顯示，這種復(fù)合物對(duì)于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖具有誘導(dǎo)作用。機(jī)體也能夠?qū)Π┘?xì)胞增殖產(chǎn)生調(diào)控作用，主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而減少受損及衰老細(xì)胞，抑制增生性疾病的發(fā)生，國(guó)外研究[10]顯示，在調(diào)控細(xì)胞凋亡的蛋白中，Beclin-1蛋白家族是參與細(xì)胞增殖及凋亡平衡的主要調(diào)控蛋白，大量的Beclin-1能夠發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，同時(shí)保護(hù)細(xì)胞存活并抑制其惡性增殖及異常積累。研究[11]表明，在子宮內(nèi)膜癌患者病灶組織Beclin-1表達(dá)量呈低水平。Bax是Beclin-1家族蛋白中的促凋亡基因，研究[12]顯示，Bax在機(jī)體組織器官中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞發(fā)生凋亡且受到死亡信號(hào)的刺激后，Bax可從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至線粒體，與線粒體膜結(jié)合形成同源二聚體并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外有研究[13]指出，Bax與線粒體膜結(jié)合后能夠促進(jìn)線粒體中細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，誘導(dǎo)并激活Caspase家族介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生加速作用。研究[14]表明，自噬作用在多個(gè)層面影響腫瘤發(fā)展，而Beclin-1是關(guān)于機(jī)體自噬的抑癌基因，其表達(dá)水平升高能夠促進(jìn)癌細(xì)胞自噬，主要通過(guò)Beclin-1對(duì)細(xì)胞自噬體成熟的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)[15]，此外Beclin-1能夠與III型磷脂酰基肌醇3激酶結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞自噬過(guò)程。有研究[9]采用雌激素樣受體拮抗劑干預(yù)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，雌激素樣受體拮抗劑可通過(guò)上調(diào)CDK4蛋白表達(dá)發(fā)揮較弱的促增殖作用。高金利等[16]研究顯示，microRNA-203-5p能夠通過(guò)靶向下調(diào)子宮內(nèi)膜癌小鼠的H編碼人表皮生長(zhǎng)因子受體4的癌基因，上調(diào)Bax的表達(dá)水平，進(jìn)而發(fā)揮誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌凋亡的作用。在本研究中，觀察組的CDK4表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Beclin-1及Bax的表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示在EC患者中存在細(xì)胞的增殖速度加快及凋亡速度減慢，與目前文獻(xiàn)報(bào)道一致[17-19]。分析后認(rèn)為，細(xì)胞自噬及凋亡功能的損害可導(dǎo)致機(jī)體無(wú)法及時(shí)清除正常細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖，故在本研究中可觀察到EC患者Bax及Beclin-1水平的降低。本研究中對(duì)不同病理特征EC患者的CDK4、Beclin-1及Bax表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CDK4在中、高分化、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者中表達(dá)水平較高，Beclin-1及Bax在中、高分化、FIGO分期III～I(xiàn)V期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)≥1/2患者中表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示Beclin-1及Bax低表達(dá)、CDK4高表達(dá)的EC患者病灶組織惡性程度更高、侵襲性更強(qiáng)、預(yù)后更差。分析后認(rèn)為，腫瘤臨床分期、病理分型及是否合并淋巴轉(zhuǎn)移是評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)情況的重要指標(biāo)，對(duì)于FIGO分期更高、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者而言，其腫瘤數(shù)量更多，疾病嚴(yán)重程度更重，可能是由于Beclin-1及Bax表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖所致。

綜上所述，EC患者病灶組織的Beclin-1、Bax及CDK4與子宮肌瘤患者存在明顯差異，Beclin-1、Bax及CDK4可作為評(píng)估EC患者預(yù)后的指標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]趙宏喜，李艷紅，謝麗，等.子宮內(nèi)膜癌的流行病學(xué)特點(diǎn)及其轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素分析[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017，25（23）：3803-3805.

[2]劉淼，齊躍，譚明子，等.PGRMC1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2019，27（5）：839-844.

[3]姚順，詹磊，孫士瑩，等.NLRC5抑制自噬促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（7）：1022-1027.

[4]佘遠(yuǎn)萍，黃玉梅.子宮內(nèi)膜癌治療的研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2020，18（16）：172-174.

[5]袁芳，吳國(guó)榮，王國(guó)仙，等.腹腔鏡分期手術(shù)治療在子宮內(nèi)膜癌患者中的應(yīng)用效果[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2020，27（6）：99-102.

[6]孫文惠子，DhrubaPaudel，歐陽(yáng)一芹，等.缺氧誘導(dǎo)因子1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，40（4）：459-463.

[7]黃驍昊，韓素萍，周雪.子宮內(nèi)膜復(fù)雜性不典型增生及早期子宮內(nèi)膜癌患者保留生育功能的預(yù)后研究[J].腫瘤學(xué)雜志，2019，25（11）：980-984.

[8]袁丹，劉蒙蒙，周正平，等.雌激素對(duì)人子宮內(nèi)膜樣癌Ishikawa細(xì)胞中p57kip2、CyclinD1、CDK4表達(dá)及形態(tài)變化影響的研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2018，27（4）：249-254.

[9]袁丹，劉俊江，周正平，等.ER拮抗劑對(duì)Ishikawa細(xì)胞中p57kip2、CyclinD1表達(dá)及形態(tài)變化的影響研究[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2019，28（1）：6-12.

[10] Haselager MV，Kielbassa K，Burg JT，et al.Changes in Bcl-2 members after ibrutinib or venetoclax uncover functional hierarchy in determining resistance to venetoclax in CLL[J].Blood，2020，18（7）：185-197.

[11]管泱，趙靜，李晗.子宮內(nèi)膜癌組織中HIF-1α、Bcl-2、β-catenin的表達(dá)與臨床生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系探討[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2020，21（5）：477-479.

[12]謝朋木.長(zhǎng)鏈非編碼RNACCAT2在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制探究[D].青島：青島大學(xué)，2017：12-16.

[13]鐘小蘭，班努·庫(kù)肯，景江新.過(guò)表達(dá)Bax抑制劑1通過(guò)抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放及細(xì)胞凋亡減輕心肌缺血再灌注損傷[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2021，29（3）：222-231.

[14]秦燕，王肖力.Livin、Beclin-1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義[J].腫瘤學(xué)雜志，2015，21（2）：128-132.

[15]趙榮演，靳文珂，姜星，等.靶向beclin-1小分子激動(dòng)劑誘導(dǎo)三陰性乳腺癌細(xì)胞自噬性死亡和凋亡[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（5）：1369-1383.

[16]高金利，虎永蘭，瓦迎芳.miR-203-5p靶向調(diào)控ERBB4基因參與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)性科學(xué)，2019，28（12）：32-37.

[17]黃勝藍(lán)，陳蘇瓊，楊瓊嬌.Beclin1及TGFβ1在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)婦幼保健，2019，34（8）：1867-1870.

[18]成繼民，陳靜，賀占國(guó)，等.子宮內(nèi)膜癌中Ki-67和Bax的表達(dá)及相互關(guān)系的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13（24）：132-133，136.

[19]張金霞，林亞.微小RNA-34在子宮內(nèi)膜癌中的功能研究[C].//中國(guó)醫(yī)藥教育協(xié)會(huì)感染疾病專業(yè)委員會(huì)第二屆學(xué)術(shù)大會(huì)、第八屆全國(guó)侵襲性真菌病實(shí)驗(yàn)室診斷及臨床治療新進(jìn)展研討會(huì)暨2016中國(guó)藥學(xué)會(huì)藥物臨床評(píng)價(jià)研究專業(yè)委員會(huì)年會(huì)論文集，2016：592.

（收稿日期：2021-09-30）