加味芩桂術湯聯合奧氮平對糖尿病大鼠P38-MAPK信號通路介導的心肌纖維化影響

蔡素華，任禮錫 (廣州中醫藥大學金沙洲醫院藥學部，廣東 廣州 510168)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病重要并發癥之一，同時也是造成糖尿病死亡的主要原因[1]。DCM的典型病理變化主要是心肌纖維化及心肌肥厚等，心肌病變的發生主要同糖尿病高血糖、高血脂狀態相關，可引起氧化應激及相關線粒體功能障礙[2]。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)屬于一種可被細胞因子、神經遞質、激素等不同的細胞外刺激等激活的促分裂原活化蛋白激酶，可起到應激調節及促炎性反應的作用。加味芩桂術湯具有活血寧心、健脾利濕、溫陽化飲的功效，現代醫學研究表明其中的黃芪可改善T細胞功能及降低肺動脈壓，減輕右前心負荷及松弛血管平滑肌，增加血流量[3]。奧氮平是非典型神經安定藥，能夠拮抗多巴胺、5-羥色胺(5-HT)及膽堿能受體。然而關于加味芩桂術湯聯合奧氮平對于調節糖尿病大鼠P38-MAPK信號通路所介導的心肌纖維化的作用機制尚且不明確[4]。基于此，本研究擬建立糖尿病大鼠模型，探討了聯合用藥的干預機制。

1 資料與方法

1.1材料：選取70只清潔級雄性SD大鼠，平均體重(204.15±8.42)g。大鼠均自由覓食飲水，在20℃～25℃溫度及50%～55%濕度的環境下進行適應性喂養，持續喂養1周后開始實驗。本次研究經過本院醫學倫理委員會同意。

1.2試劑：奧氮平(江蘇豪森藥業集團有限公司，國藥準字H20010799，規格10 mg*7 s)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；兔抗鼠P38-MAPK抗體(北京博奧森公司)。

1.3方法

1.3.1造模：按30 mg/kg體重的劑量腹腔內注射鏈脲佐菌素，5 d后檢測血糖指標不達標者再按25 mg/kg體重的劑量腹腔內注射鏈脲佐菌素。造模成功的標準為最后1次注射5 d后測定尾靜脈隨機血糖，認為血糖≥16.7 mmol/L者為造模成功。

1.3.2分組：最終40只大鼠建模成功，然后按照隨機數字表法分成模型組、加味芩桂術甘湯組、奧氮平組、加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組，每組各10只大鼠。其余的30只未建模成功的大鼠納入為對照組。模型組與對照組均給予0.9% NaCl溶液5 ml/(kg·d)，奧氮平組給予10 mg/d灌注。加味芩桂術甘湯組給予加味芩桂術甘湯，基礎組方如下：甘草6 g、酒軍8 g、麻黃8 g、桔梗 10 g、陳皮10 g、大腹皮10 g、川芎10 g、丹參30 g、黃芪30 g、茯苓30 g、葶藶子15 g、白術15 g、桂枝15 g。辨證加減，對紫紺嚴重者加澤蘭20 g；氣虛乏力者加人參10 g；腹脹納差者加厚樸15 g；痰多咯痰不爽者加萊菔子5 g、枳實5 g、半夏5 g。1次/d，連續8周。加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組同時給予兩種藥物干預。

1.4觀察指標：各組均在喂養8周后處死大鼠，取組織進行病理形態學觀察、超聲心動圖檢查及P38-MAPK蛋白表達。①病理形態學觀察:稱重左心室重量，取心尖部分置于4%多聚甲醛固定48 h，固定的心肌組織脫水及石蠟包埋，制作切片后Masson染色、脫水、透明并封片固定，阿光鏡下觀察心肌細胞及膠原形態，采取計算機軟件定量分析心肌膠原含量。②超聲心動圖檢查:實驗末進行超聲心動圖檢查，清晰顯示胸骨旁長軸切面，測量舒張末期左室內徑、右室內徑、收縮末期左房內徑及左室射血分數。③應用Western印跡檢測P38-MAPK蛋白表達情況，主要取各組小鼠左心室心肌組織提取蛋白，經增強化學發光法顯色及曝光后掃描，利用Image J圖像分析軟件做光密度分析，經β-actin為內參。

1.5統計學方法：所有數據用統計軟件SPSS19.0進行分析。計量資料不同組間參數的比較采用方差分析，對有差異結果進一步采用q檢驗進行兩兩比較，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1病理形態學觀察：經Masson染色，光鏡下顯示對照組大鼠細胞核呈深藍色，膠原纖維染成藍綠色，少量均勻分布，心肌細胞染成紅色。模型組大鼠心肌細胞間質膠原纖維表達增加、排列紊亂及分布不均；加味芩桂術甘湯組、奧氮平組、加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組心肌膠原分布均勻，膠原表達量減少，具體以聯合組表現更為明顯。

2.2心臟血流動力學：模型組在舒張末期左/右室內徑、收縮末期左房內徑上比對照組更高，左室射血分數比對照組更低，而經不同治療方式的各模型組各指標均改變，其中加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組變化最為明顯，同對照組接近度高。見表1。

表1 各組大鼠心臟血流動力學指標比較

2.3心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達：各組治療后心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達情況見表2，模型組水平最高，各治療組在指標水平上均較模型組降低，其中以加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組降低最明顯，同對照組一致性高。見表2。

表2 各組大鼠心肌膠原含量、P38-MAPK蛋白表達水平比較

3 討論

DCM是糖尿病典型病變，病機復雜，目前多數資料顯示P38-MAPK信號通路活化是關鍵機制，P38-MAPK信號通路促進下游轉錄因子核因子κB活化，啟動相關炎性因子轉錄及表達，引起心肌纖維化，加劇DCM損傷[5-6]。

本研究結果顯示，模型組大鼠存在明顯P38-MAPK信號通路活化，而奧氮平組、加味芩桂術甘湯組、加味芩桂術甘湯聯合奧氮平組經治療可有效抑制P38-MAPK信號通路活化，這樣發揮抗炎及抗心肌纖維化的目的，在大鼠各血流動力學變化上，聯合組也更明顯，表明加味芩桂術湯聯合奧氮平作用突出。主要是加味芩桂術甘湯可起到活血寧心、健脾利濕、溫陽化飲的功效，現代藥理研究也顯示，黃芪能夠有效促進慢性肺心病患者的T細胞功能，將患者肺動脈壓降低，將其右心前負荷減輕，川芎能夠促使血管平滑肌松弛，將肺心血管擴張，增加血流量，將微循環有效改善，將肺動脈高壓降低，促使患者的心功能得到有效改善。奧氮平拮抗多巴胺、5-羥色胺(5-HT)及膽堿能受體，通過聯合作用可調節大鼠心臟功能，下調P38-MAPK信表達，抑制嚴重及抗心肌纖維化[7-8]。

綜上所述，加味芩桂術甘湯聯合奧氮平對糖尿病大鼠的心肌有保護作用，可能機制是下調P38-MAPK蛋白表達，這讓以P38-MAPK信號通路為切入點的治療方式提供理論及實踐依據。