熒光定量PCR法與免疫組織化學法檢測胃黏膜活檢標本幽門螺桿菌感染的價值對比

蔣樟英 (福州市中醫院，福建 福州 350001)

幽門螺桿菌(Hp)是導致胃炎、胃消化性潰瘍等疾病的關鍵致病菌，和胃癌發生有緊密聯系，嚴重威脅人類生命安全，所以早檢出、早治療對于Hp感染患者很重要。胃黏膜活檢標本檢測是檢測Hp感染主要途徑，其中熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法與免疫組織化學法又是檢測胃黏膜活檢標本中Hp感染情況主要檢測方法，其中免疫組織化學法是將帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應與組織化學的呈色反應，可對相應抗原進行定性、定量[1]，熒光定量PCR是一種在DNA擴增反應中以熒光化學物質檢測每次PCR循環后產物總量的方法，以上兩種方式在臨床應用較為廣泛。基于此，本研究就熒光定量PCR法與免疫組織化學法檢測胃黏膜活檢標本Hp感染的價值對比進行探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 ：經患者及家屬同意并簽署知情同意書，醫院倫理委員會批準將我院2019年3月～2021年3月收治的178慢性胃炎患者的病理活檢標本進行收集，均符合胃炎診斷標準[2]且經病理證實。男98例，女80例；男患者年齡38～72歲，平均年齡(54.36±12.16)歲；女患者年齡37～70歲，平均年齡(53.42±11.13)歲。所有患者性別、年齡對比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法：

1.2.1儀器和試劑：采用免疫組織化學染色儀(Leica BOND-MAX)，全自動熒光定量PCR儀(ABI7500)；試劑盒由Dako公司生產，DNA提取試劑盒(厚生博泰科技)；Hp鑒定試劑盒(達安基因股份)。

1.2.2檢測方法：①免疫組織化學法:將所有病理活檢標本切取4 μm薄片，設立陰陽性對照；選擇免疫組織化學染色儀(Leica BOND-MAX)進行染色，黏膜黏液層、表面、小凹以及腺管表面上皮有棕黃色著色的菌體為Hp陽性。感染強度的判斷:觀察胃黏膜黏液層、表面、小凹以及腺管表面上皮的Hp菌體，未見Hp則為無；少見或者Hp菌體長度<標本全長的三分之一則為輕度感染(+)；Hp菌體長度介于標本全長的三分之一到三分之二之間則為中度感染(++)；Hp菌體成堆存在并且在整個標本上均有分布則為重度感染(+++)[3]。②熒光定量PCR法：選擇全自動熒光定量PCR儀(ABI7500)檢測，將標本制成蠟塊后切取4 μm薄片裝入EP管中，每切取1例標本均用消毒液清潔刀口和周圍，避免污染。在加入薄片的EP管中加入TL緩沖液220 μl，90℃下放置60 min，室溫放置1 min，1 200 r/min離心2 min，穿過石蠟層抽取200 μl液體于新EP管中，加入40 μl的蛋白酶K，混勻離心收集管蓋上液體，55℃下水浴2 h，間隔20 min混勻一次，以組織液完全消化為標準。以1 200 r/min離心2 min，準備一個新的EP管，并將離心后的上清液放置到該EP管中，加入220 μl BL緩沖液和4 μl線性丙烯酰胺，混勻離心，收集管蓋上液體，70℃下水浴10 min。加入220 μl無水乙醇，顛倒混勻，將混合液轉移至DNA吸附柱中，放置1 min，8 000 r/min離心30 s，棄去濾液，加入500 μl HB緩沖液，放置1 min，8 000 r/min離心30 s，棄去濾液，加入500 μl DNA洗滌液，放置1 min，8 000 r/min離心30 s，棄去濾液，12 000 r/min離心2 min，去除DNA吸附膜上的乙醇。把DNA吸附柱裝入新的EP管內，加入70℃預熱的洗脫緩沖液50 μl，靜置2 min，12 000 r/min離心2 min，將提取完成的組織DNA和配制好的PCR擴增劑混勻，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，設置循環參數，計算閾值(Ct)和ΔCt，ΔCt>3為+，0<ΔCt≤3為++，ΔCt≤0.00為+++[4]。

1.3觀察指標和評價標準:兩種檢測方式的診斷價值、Hp感染的強度的一致性(Kappa值)以及對輕中重度感染的檢出情況。

1.4統計學方法：數據錄入SPSS22.0軟件中分析，計數資料采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1熒光定量PCR法和免疫組織化學法對Hp感染的診斷價值比較：熒光定量PCR法陽性率為33.15%，陰性率為66.85%和免疫組織化學法陽性率28.65%，陰性率71.35%對比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 熒光定量PCR法和免疫組織化學法對Hp感染的診斷價值比較[n(%),n=178]

2.2免疫組織化學法和熒光定量PCR法檢測Hp感染強度比較： 兩種檢測方式一致性好，Kappa值為0.610。見表2。

表2 免疫組織化學法和熒光定量PCR法檢測Hp感染強度比較

2.3兩種檢測方式對輕中重度感染的檢出比較：熒光定量PCR法較免疫組織化學法分布更均勻，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩種檢測方式對Hp感染輕中重度的檢出比較[n(%)]

3 討論

Hp感染是消化內科常見的感染細菌，但感染后通常引起慢性淺表性胃炎而無臨床癥狀，隨著時間發展可能會導致胃潰瘍以及胃癌[5]，對患者生命安全造成嚴重威脅，因此有效快速的檢出Hp指導對后期對癥治療很重要。臨床對于Hp的測定主要通過胃黏膜活檢完成，目前對于活檢的檢測手段多種多樣，其中免疫組織化學法利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色，從而來確定組織細胞中抗原情況；熒光定量PCR法是一種直接檢測核酸的分子生物學技術，通過對提取的DAN進行PCR高效擴增后觀察熒光信號，直接進行借助熒光定量，為了尋找一種更為有效的檢出方式我院對熒光定量PCR法與免疫組織化學法進行研究。

本研究說明熒光定量PCR法和免疫組織化學法對Hp感染均可進行有效檢測。因為免疫組織化學法和熒光定量PCR法均作為一種侵入性檢測，其中免疫組織化學法通過抗原抗體反應原理，利用化學反應使標記抗體的顯色劑顯色對Hp進行分子以及形態檢測；熒光定量PCR法通過兩條和靶DNA兩端互補的寡核苷酸引物，利用酶促反應合成特異片段的體外擴增技術，分析熒光信號變化情況測定是否存在Hp感染，感染時熒光信號出現S型號變化，敏感性以及特異性強。

本研究說明熒光定量PCR法對輕中重度Hp感染的檢出效果更好。在本研究中可見，熒光定量PCR法檢測分布較均衡，而免疫組織化學法檢出的重度較多，而對輕中度的檢出較少，說明免疫組織化學法對輕中度的檢出可能存在漏診的情況。因為熒光定量PCR法特異性識別Hp物種特異基因DAN探針以及擴增引物，通過熒光定量儀直接定量核酸數量，反應過程均在封閉管中進行，不受人基因以及其他物種基因影響，因此熒光定量PCR法檢測分布較均衡，在張睿祺等[6]人研究中，熒光定量PCR法檢出輕、中、重度感染例數分別為6、12、10例，而免疫組織化學法檢測輕、中、重度感染例數分別為3、4、16例，說明熒光定量PCR法對輕中重度Hp感染的檢出效果更好，支持本研究。

綜上所述，熒光定量PCR法和免疫組織化學法均可檢測Hp感染，但與免疫組織化學法相比，熒光定量PCR法對輕中重度Hp感染的檢出效果更好。