二代測序技術(shù)在社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體肺炎診斷中的應(yīng)用價值

張連霞 于世杰 康千寬 趙慧霞 曹鄂洪

鸚鵡熱衣原體肺炎為人畜共患疾病,在多數(shù)歐美國家、日本及我國香港等地該疾病已被列入法定傳染病進(jìn)行監(jiān)管。鸚鵡熱衣原體肺炎常表現(xiàn)為高熱(＞39.1℃),伴全身酸痛不適,同時有咳嗽咳痰等癥狀,胸部CT以單側(cè)或雙側(cè)肺葉實變?yōu)橹?可伴有胸腔積液［1］。目前尚無可靠的流行病學(xué)資料。因為鸚鵡熱衣原體為胞內(nèi)微生物,常規(guī)痰涂片、培養(yǎng)以及血清學(xué)檢驗中可能會出現(xiàn)誤診和漏診的情況,因此會延誤治療時機(jī),影響患者的康復(fù)。二代測序技術(shù)能夠?qū)Σ≡⑸锘蚱芜M(jìn)行信息獲取獲得病原體的遺傳信息,且具有高度敏感性。與此同時能夠針對常規(guī)檢測不敏感的病菌微生物進(jìn)行證據(jù)獲取。本實驗選取4 例社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體肺炎患者作為研究對象,進(jìn)一步探討二代測序技術(shù)的診斷優(yōu)勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年12 月1 日～2020 年12 月1 日在南京同仁醫(yī)院住院的4 例社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體肺炎患者作為研究對象,年齡52～66歲,中位年齡58 歲；其中男0 例,女4 例。臨床主要表現(xiàn)為早期以呼吸系統(tǒng)癥狀起病,但均為高熱(＞39.1℃),伴全身酸痛不適,同時有咳嗽咳痰等癥狀,可伴有胸腔積液。本研究由南京同仁醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。患者均已簽署知情同意書。

1.2 方法 4 例患者均進(jìn)行二代測序技術(shù)檢測。

1.2.1 標(biāo)本采集 患者入院后均完善常規(guī)檢查及電子支氣管鏡術(shù)前準(zhǔn)備(凝血功能、血氣分析、心電圖等),完善痰液培養(yǎng)及呼吸道8項(含衣原體IgM抗體)檢測；需要告知患者進(jìn)行支氣管鏡檢查的風(fēng)險性以及必要性,同時介紹相關(guān)費用,由患者同意后執(zhí)行。此外在術(shù)中需要全面監(jiān)測患者的生命體征,并使用1%利多卡因先霧化后噴霧行咽喉部表面麻醉。在實施競選前需要充分吸氧,隨后實施肺泡灌洗,留取經(jīng)支氣管肺泡灌洗液(BALF) 5～10 ml。

1.2.2 標(biāo)本保存和轉(zhuǎn)運 將5 ml BALF冷藏在4℃下進(jìn)行保存,并在24 h 內(nèi)進(jìn)行檢驗。

1.2.3 標(biāo)本處理和DNA 提取 取受試者3 ml(體積)樣本,首先經(jīng)過15000g、4℃、10 min 獲取樣本富集液；取200μl 通過磁珠法(MAGEN Guangzhou,CHINA)進(jìn)行DNA 提取與純化；根據(jù)建庫試劑盒Nextera XT(illumina,USA)說明書構(gòu)建宏基因組文庫(文庫大小：～300 bp)；經(jīng)Aglient 2100進(jìn)行文庫分析,通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)(Bio-Rad CFX96,USA)精準(zhǔn)定量；將加有不同index 接頭序列的文庫等量混合,應(yīng)用illumina nextseq 550 DX測序平臺完成高通量測序(測序策略：SE75)。

1.3 觀察指標(biāo) 分析患者的臨床特點及檢驗結(jié)果、臨床治療方案和療效。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床特點分析 4 例患者均為52～66 歲的老年家庭婦女,典型表現(xiàn)(高熱、咳嗽)、衣原體抗體IgM 檢測結(jié)果及痰培養(yǎng)均為陰性；胸部CT 以單側(cè)肺葉實變?yōu)橹鳌Ｒ姳?。

表1 患者的臨床特點

2.2 檢驗結(jié)果 4 例患者的ALF 二代測序結(jié)果均于2 d后回報,可見鸚鵡熱衣原體種屬基因檢出的序列數(shù)為1～61 個,中位檢出序列數(shù)為24 個；二代測序技術(shù)陽性檢出率為75.00%(3/4)。

2.3 治療方案及療效 對4例患者的治療方案均進(jìn)行調(diào)整,其中病例1 通過莫西沙星聯(lián)合亞胺培南西司他丁抗感染治療臨床顯示無效,仍反復(fù)發(fā)熱,后調(diào)整為多西環(huán)素治療好轉(zhuǎn)；病例2 經(jīng)莫西沙星治療,病例3 通過甲磺酸左氧氟沙星聯(lián)合哌拉西林鈉他唑巴坦抗感染治療后患者仍反復(fù)發(fā)熱,且出現(xiàn)皮疹,調(diào)整為阿奇霉素聯(lián)合亞胺培南西司他丁抗感染治療均好轉(zhuǎn)；病例4 給予頭孢唑肟聯(lián)合莫西沙星抗感染治療仍有反復(fù)發(fā)熱,調(diào)整為口服米諾環(huán)素后好轉(zhuǎn)。

3 討論

鸚鵡熱衣原體主要宿主為鸚鵡、鴿子等鳥類,帶菌或發(fā)病的家禽及外觀健康但排菌的觀賞鳥類是重要的傳染源。禽類養(yǎng)殖場、宰殺、銷售、轉(zhuǎn)運乃至調(diào)教基地等均可能是傳染場所。吸入受鸚鵡熱衣原體污染的氣溶膠可引起發(fā)病,但甚是罕見［2,3］。國外相關(guān)文獻(xiàn)報道,鸚鵡熱衣原體肺炎約占社區(qū)獲得性肺炎的1%［4］,但因確診困難,目前無可靠的流行病學(xué)資料。本次研究患者均為52～66 歲的家庭主婦,有可疑接觸禽類市場,為病原菌的可疑來源。

本次研究中4 例患者的特點分析：①早期表現(xiàn)以呼吸系統(tǒng)癥狀起病,但均為高熱(＞39.1℃),伴全身酸痛不適,不同于支原體肺炎以中等度發(fā)熱為主；②病例1 伴明顯心悸,病例1 和3 均伴有腰痛。有報道部分臨床癥狀可表現(xiàn)為腹瀉、心律失常、心肌炎、皮疹、腦炎、肝炎等［5-7］；③病例1、病例3、病例4 均伴有轉(zhuǎn)氨酶異常,其中病例3 病程中出現(xiàn)皮疹；④胸部CT 以單側(cè)或雙側(cè)肺葉實變?yōu)橹?可伴有胸腔積液。

我國衣原體的檢測方法包括病原學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)檢測［8］。病原學(xué)檢測是確診方法,但陽性率低(20%左右)、耗時長及技術(shù)、設(shè)備要求高。在實際工作中,微量免疫熒光法(MIF)是國際上最常用的衣原體診斷方法［9］。本次研究中4 例患者均行常規(guī)痰液培養(yǎng)陰性,衣原體抗體IgM 檢測陰性,均經(jīng)BALF 送檢二代測序技術(shù)明確診斷。

宏基因組新一代測序技術(shù)(metagenomics next generation sequencing,mNGS)可直接對被檢測樣本中的核酸進(jìn)行高通量測序,通過與數(shù)據(jù)庫對比,從而判斷被檢樣本所包含的病原微生物種類［10］。本研究結(jié)果顯示,二代測序技術(shù)對社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體的診斷可行。目前針對二代測序技術(shù)檢測病原體的結(jié)果判定還尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),Somasekar 等定義mNGS 的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn),針對細(xì)菌、真菌、寄生蟲每百萬映射讀取的Reads(rpm)＞陰性對照的10 倍,針對病毒Reads＞20 倍且覆蓋度＞2%。與本研究病例結(jié)果不十分一致,這也反映出應(yīng)結(jié)合臨床判讀二代測序結(jié)果。本研究中的不足之處在于mNGS 陽性的結(jié)果未進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)驗證。另外,由于目前耐藥基因庫尚未完善,二代測序技術(shù)對微生物耐藥性的檢測作用有限,需臨床醫(yī)生根據(jù)當(dāng)?shù)丶?xì)菌藥敏試驗的大數(shù)據(jù)指導(dǎo)臨床用藥。目前鸚鵡熱衣原體肺炎抗菌首選四環(huán)素類藥物。有一項體外藥敏試驗結(jié)果提示莫西沙星對衣原體具有較強的抗菌活性［11］。國外僅有個案報道提示喹諾酮類藥物治療有效［12］。本次研究中病例1 通過莫西沙星聯(lián)合亞胺培南西司他丁抗感染治療臨床顯示無效,仍反復(fù)發(fā)熱,后調(diào)整為四環(huán)素口服好轉(zhuǎn)；病例2 采用莫西沙星、病例3 通過阿奇霉素抗感染治療均好轉(zhuǎn)；病例4 給予頭孢唑肟聯(lián)合莫西沙星抗感染治療仍有反復(fù)發(fā)熱,調(diào)整為口服米諾環(huán)素后好轉(zhuǎn)。近年在我國已有報道衣原體屬中的沙眼衣原體對四環(huán)素類藥物耐藥性明顯增高,今后應(yīng)進(jìn)一步針對耐藥基因庫的建立及鸚鵡熱衣原體亞單位疫苗研發(fā)。

綜上所述,二代測序技術(shù)診斷社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體肺炎,其方法更快速、準(zhǔn)確、全面,可作為社區(qū)獲得性鸚鵡熱衣原體肺炎的診斷方法之一。