氣相色譜法測(cè)定石杉?jí)A甲合成中間體基因毒性雜質(zhì)苯硫酚

陳安，孫利榮，趙云超，李娟

萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)有限公司，浙江 溫嶺 317500

石杉?jí)A甲（huperzine A）是從石杉科植物千層塔中分離得到的一種天然生物堿，是一種具有高特異性且可逆的乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑［1-2］。石杉?jí)A甲在動(dòng)物模型中表現(xiàn)出能夠減弱或者逆轉(zhuǎn)認(rèn)知損害［3-4］，在臨床上也已經(jīng)被證明能顯著改善衰老性健忘老年人和老年癡呆或血管性癡呆患者的記憶缺陷，不良反應(yīng)發(fā)生率低，有較好的臨床安全性［5-6］。1996 年，石杉?jí)A甲在國(guó)內(nèi)按二類新藥批準(zhǔn)其用于阿爾茨海默病（AD）的治療［7］。

石杉?jí)A甲易透過血腦屏障、作用時(shí)間長(zhǎng)、口服利用度高，被許多醫(yī)院廣泛應(yīng)用于AD 的治療［8-9］，而通過植物提取所得到的石杉?jí)A甲得率低，極大限制了其臨床應(yīng)用，通過人工合成的方法能夠?qū)崿F(xiàn)石杉?jí)A甲產(chǎn)業(yè)化［10］。1989 年，A.P.Kozikowski 課題組［11-12］實(shí)現(xiàn)了石杉?jí)A甲的全合成，之后，嵇汝運(yùn)院士所在課題組［13］對(duì)石杉?jí)A甲合成工作做了總結(jié)。在合成石杉?jí)A甲中間體過程中使用了苯硫酚鈉而產(chǎn)生了苯硫酚，苯硫酚具有較高毒性，危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致肌肉萎縮、呼吸困難、昏迷等癥狀［14-16］，因而建立一種苯硫酚的檢測(cè)方法非常重要。目前，未見有基因毒性苯硫酚質(zhì)量控制的氣相色譜方法報(bào)道。為有效控制石杉?jí)A甲的質(zhì)量和用藥安全，本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜法對(duì)苯硫酚進(jìn)行考察，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，為石杉?jí)A甲合成中間體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

7890B 型氣相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；MS205DU 型電子天平（瑞士梅特勒公司）。

1.2 試藥

苯硫酚（分析純，純度99.0%，批號(hào)：11872，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）；乙酸（分析純，批號(hào)：20190810，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)：0114210101，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆皇級(jí)A甲合成中間體（LE-11，甲基（5R，9R，E）-11-亞乙基-2-甲氧基-7-甲基 -9,10-二氫-5,9-甲基環(huán)辛基［b］吡啶-5（6H）-羧酸鹽，CAS：185741-44-0，批號(hào)：QSSJJ11191001，萬(wàn)邦德制藥集團(tuán)有限公司提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)條件

色譜條件：島津Inert Cap 5 毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm×1.5 μm）；升溫程序：起始柱溫為40 ℃，維持10 min，以10 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，以30 ℃/min的速率升溫至280℃，維持19 min；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測(cè)器為FID，檢測(cè)器溫度為280 ℃；空氣流量為300 mL/min；氫氣流量為30 mL/min；尾吹氣25 mL/min；載氣為氮?dú)猓髁繛?.0 mL/min；分流比為5∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 空白溶液 以乙腈:乙酸（97∶3，v/v）為空白溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取苯硫酚101.22 mg，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1；精密移取10 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2；精密移取10mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2，置于100 mL 量瓶中，用空白溶液稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照品溶液。

2.2.3 加標(biāo)供試品溶液 精密稱取1.0 g 的LE-11，置于10 mL 量瓶中，精密移入1.0 mL 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2，加空白溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得加標(biāo)供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下配制的空白溶液、對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，空白溶液無(wú)干擾峰，加標(biāo)供試品溶液中中苯硫酚與供試品自帶的雜質(zhì)峰之間分離度為4.96，理論塔板數(shù)和拖尾因子均符合要求，表明專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 各1.5、3.0、5.0、7.5、10.0 mL，分別置于50 mL 量瓶中，加入空白溶液稀釋至刻度，搖勻。分別精密移取上述系列溶液置于進(jìn)樣瓶中，加蓋密封。按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)（μg/mL）、峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=2.816 4X-1.770 5，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，結(jié)果表明苯硫酚在3.006 2～20.041 6 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度考察 精密量取對(duì)照品溶液置于進(jìn)樣瓶中，密封搖勻，平行配制6 份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析測(cè)定，計(jì)算得到苯硫酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.79%（n=6），表明精密度良好。

2.3.4 檢測(cè)限和定量限 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋成一定濃度，分別進(jìn)樣，以信噪比為3 時(shí)（S/N=3）的濃度作為最低檢測(cè)限度（LOD），以信噪比為10 時(shí)（S/N=10）作為定量檢測(cè)限濃度（LOQ），結(jié)果：苯硫酚檢測(cè)限為0.995 5 μg/mL，定量限為2.986 6 μg/mL。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取LE-11 供試品各約1.0 g（共9 份），精密稱定，分別置于10 mL 量瓶中，精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2 各0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL 量瓶中，配制低、中、高3 種質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度溶液配制3 份，加入空白溶液超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見圖1），計(jì)算回收率。回收率結(jié)果見表1，表明殘留溶劑回收率滿足要求。

表1 苯硫酚回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.6 耐用性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液各1 μL（因?yàn)榧児┰嚻分斜搅蚍拥牧亢苌伲荒芎芎玫乜疾毂搅蚍釉诠┰嚻分械姆蛛x度，所以采用供試品加標(biāo)的方式進(jìn)行考察苯硫酚在供試品中的分離度），進(jìn)樣分析，微小改變“2.1”項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定，記錄色譜圖（見圖1），計(jì)算得出理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度。結(jié)果見表2，表明初始溫度變化±2 ℃、載氣流速變化±0.2 mL/min、更換不同批號(hào)的色譜柱、初始保留時(shí)間±1min，以及升溫速率±2 ℃/min 條件下，方法的耐用性良好。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 氣相色譜圖：A.空白溶液；B.對(duì)照品溶液；C.加標(biāo)供試品溶液

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液和加標(biāo)供試品溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，置于進(jìn)樣瓶中，密封搖勻，依次于0、3、6、9、12、18、24、36、48 h 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以各時(shí)間點(diǎn)苯硫酚峰面積與0 h 苯硫酚峰面積的比值作為衡量溶液是否穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)（80%～120%）。結(jié)果見表3，說明對(duì)照品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，加標(biāo)供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 含量測(cè)定 分別精密稱取1.0 g LE-11，置于10 mL 量瓶中，使用空白溶液超聲溶解，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果供試品溶液中的苯硫酚含量為0.001%。

3 討論與結(jié)論

氣相色譜法的進(jìn)樣方式有頂空進(jìn)樣法和直接進(jìn)樣法，低沸點(diǎn)溶劑適合頂空進(jìn)樣，高沸點(diǎn)溶劑適合直接進(jìn)樣［17-18］。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，苯硫酚在頂空進(jìn)樣時(shí)發(fā)現(xiàn)無(wú)響應(yīng)，直接進(jìn)樣能很好出峰，故最終選擇直接進(jìn)樣的方式。

苯硫酚不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，且針對(duì)石杉?jí)A甲中間體LE-11 的溶解性，開始選擇乙腈∶乙酸乙酯作為空白溶液進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照品溶液中苯硫酚比較穩(wěn)定，但是當(dāng)苯硫酚加入到供試品溶液3 h后苯硫酚變得不穩(wěn)定，由于苯硫酚在弱酸性的環(huán)境下，它會(huì)形成自由基，而這些自由基可能會(huì)跟樣品中的不飽和烴加成，最終使苯硫酚降解，故我們選擇在溶液中加入一定量的酸，使我們的溶液變成酸性，讓苯硫酚不那么容易形成自由基；經(jīng)過試驗(yàn)調(diào)整最終選擇乙腈∶乙酸=97∶3（v/v）作為空白溶液。

由于選擇了直接進(jìn)樣的方式，樣品的主成分也會(huì)有出峰的可能，且其沸點(diǎn)較高，選擇弱極性的色譜柱可以快速有效的分析，所以本試驗(yàn)選擇島津Inert Cap 5 作為色譜柱，該色譜柱獨(dú)特的內(nèi)壁表面去活技術(shù)徹底清除了殘余在管內(nèi)表面的鹵代化合物、硅烷醇基團(tuán)和金屬粒子，保障了在快速分析的同時(shí)能有一個(gè)較好的峰型。

通過對(duì)專屬性、儀器精密度、檢測(cè)限和定量限、加樣回收率、穩(wěn)定性、耐用性等方法學(xué)考察，說明本方法能夠?qū)蚨拘噪s質(zhì)苯硫酚進(jìn)行較好的質(zhì)量控制。