超高效液相色譜-質譜法檢測婦科止帶膠囊中馬皮源成分

黃曉燕，李榮瑋，劉雁鳴，梁晟，李瑞蓮

湖南省藥品檢驗檢測研究院，湖南省藥品質量評價工程技術中心，湖南 長沙 410001

婦科止帶膠囊具有收斂止帶、清熱燥濕等功效，臨床上常用于治療濕熱型赤白帶等癥［1］。本品為中藥復方制劑，由椿皮、龜甲、阿膠等7 味藥材組成，處方中龜甲制備方法為加水煎煮，故在提取過程中能生成龜甲膠成分。

目前，市場上驢皮、龜甲原料供應緊缺，價格昂貴，某些不法生產企業為了謀取更高的經濟效益，可能出現將馬皮充當正品膠類投料造假摻偽等現象，嚴重影響著患者的用藥安全。為了保證膠類藥材的質量及打擊摻偽造假，藥品監管部門陸續出臺一系列的檢驗檢測方法［1-4］。婦科止帶膠囊現行質量標準為《中國藥典》2020 年版一部，正文項下收載有阿膠的特征肽鑒別。本品雖有阿膠的鑒別項目，但無檢測雜皮投料的項目，難以對馬皮造假和摻假的現象進行檢查和監管。因此，本研究根據有關文獻［5-9］報道中的測定方法，采用超高效液相色譜-質譜（UPLC-MS）識別技術，建立了馬皮源成分的限量檢查方法，并對收集到的婦科止帶膠囊樣品進行測定，以便為含膠類中成藥產品質量控制和科學監管提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AE240 電子分析天平（METTLER）；SBL-30DT超聲波清洗器（寧波新芝有限公司）；Ultimate3000-TSQ 液質聯用儀（DIONEX）。

1.2 試藥

馬源寡肽A 對照品（批號：112035-202002，純度：90.5%）；阿膠對照藥材（批號：121274-201904）均由中國食品藥品檢定研究院提供。所用甲酸、乙腈為質譜純，胰蛋白酶為質譜級（Sigma 公司），水為蒸餾水，試驗用的其他試劑均為分析純。8 批婦科止帶膠囊樣品均從市場上購得（企業A，樣品批號：1803002、1906001，規格：每粒裝0.3 g；企業B，樣品批號：1905002、1901001、1811005、1807004、1805003，規格：每粒裝0.3 g；企業C，樣品批號：20200501，規格：每粒裝0.46 g）。陰性樣品按處方自行制備而得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm），進樣量為5 μL，柱溫為35 ℃，流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫：0～5 min，5% A；5～10 min，5% →20% A；10～12 min，20%→50% A；流速為0.3 mL/min。

2.2 質譜條件

ESI+模式，離子源溫度110 ℃，毛細管電壓為3.1 kV，鞘氣流速600 L/h，去溶劑化溫度350 ℃，掃描模式為MRM。選擇m/z 386.4（雙電荷）→377.3（定量用）、m/z 386.4（雙電荷）→322.3 為檢測離子對，碰撞能量為25 V，檢測離子對的MRM 色譜峰的信噪比均不得小于10∶1。

2.3 對照品溶液的制備

阿膠基質溶液的制備：精密稱取阿膠對照藥材粉末，用1%碳酸氫銨水溶液溶解制成每1 mL 含2 mg 的基質溶液，即得。

精密稱取馬源寡肽A 對照品10.05 mg，置于50 mL 容量瓶中，用阿膠基質溶液溶解并稀釋至刻度，即得對照品貯備液。取馬源寡肽A 對照品貯備液，用阿膠基質溶液稀釋制成0.2 μg/mL 的溶液，取適量該溶液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，精密量取100 μL，加入制備好的胰蛋白酶溶液10 μL（1 μg/μL），混勻，水浴恒溫（37 ℃）酶切處理12 h，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取婦科止帶膠囊樣品20 粒內容物，研勻，取約0.3 g，精密稱定，置于50 mL 容量瓶中，加1%碳酸氫銨水溶液約45 mL，置于超聲波清洗儀中提取（功率840 W，頻率40 kHz）30 min 使樣品溶解，用1%碳酸氫銨水溶液稀釋至刻度，搖勻，取適量上清液，用微孔濾膜（孔徑0.22 μm）過濾，精密量取續濾液100 μL，加入胰蛋白酶溶液10 μL，同對照品制備方法進行酶切處理，即得。

2.5 陰性樣品溶液制備

稱取自行制備的缺阿膠、龜甲的陰性樣品約0.3 g，同供試品制備方法制成陰性樣品溶液。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 按“2.1”及“2.2”項下條件，吸取馬源寡肽A 對照品溶液、陰性樣品溶液與婦科止帶膠囊供試品溶液各5 μL，進行測定。結果婦科止帶膠囊中其他藥味對膠類特征肽測定無干擾，方法專屬性強，見圖1。

圖1 不同溶液中馬源寡肽A特征離子色譜圖:A.馬源寡肽A對照溶液；B.陰性樣品溶液；C.樣品溶液

2.6.2 穩定性試驗 取馬源寡肽A 對照品溶液，于配制后的0、4、12、24 h，分別按“2.1”及“2.2”項下條件測定。結果馬源寡肽A 的峰面積值RSD 為5.2%。

2.6.3 精密度試驗 按“2.1”及“2.2”項下條件，吸取馬源寡肽A 對照品溶液，連續6 次測定。結果馬源寡肽A 定量離子對的峰面積值RSD 為4.9%，儀器精密度較好。

2.6.4 線性關系 吸取適量對照品貯備液，制成含0.036 38、0.072 76、0.181 9、0.363 8、0.727 6 μg/mL 的系列溶液，依法測定，繪制標準曲線。橫坐標為對照品的量，縱坐標為定量離子對峰面積值，結果回歸方程：Y=1.0×106X+21 161，r=0.997 8，結果表明在0.036 38～0.727 6 μg/mL 范圍內，馬源寡肽A 摻入量與色譜峰面積呈線性關系。

2.6.5 檢出限 取馬源寡肽A 對照品貯備液進行逐級稀釋，以馬源寡肽A 肽定量離子對色譜圖信噪比為3∶1 計算檢出限，檢出限為1.8 ng/mL。

2.6.6 回收率試驗 取婦科止帶膠囊樣品（批號：1905002，未檢出馬源寡肽A）6 份，每份稱取約0.3 g，分別加入0.363 8 μg/mL 的對照品溶液25 mL，再加1%碳酸氫銨水溶液約20 mL，同“2.4”項下方法制備溶液，采用馬源寡肽A 定量離子對依法測定，平均回收率為93.59%，RSD 為3.69%，結果表明回收率較好，方法可行。

表1 回收率試驗

2.7 樣品測定結果

取婦科止帶膠囊樣品，照“2.4”項下方法制備，按“2.1”及“2.2”方法測定。結果3 家企業的8批樣品均未檢出馬源寡肽A。

3 討論

3.1 基質效應考察

為了考察樣品中的基質對待測成分的影響，分別以相應濃度的阿膠、陰性樣品溶液為基質，配制參比溶液，并與以碳酸氫銨溶液為溶劑的參比溶液進行比較，結果以阿膠基質和以陰性樣品基質所得的參比溶液響應值接近，為了便于標準執行，選擇以阿膠基質進行參比溶液的制備。

3.2 限度的擬定

為了避免發生客觀原因驢皮中混入微量馬皮造成結果誤判的情況，規定馬皮源成分的檢出比例十分有必要。參考文獻中的相關限度規定［8-9］，將婦科止帶膠囊樣品馬皮源成分檢查的限度定為5%，即大于5%可判定為存在馬皮源摻偽，小于或等于5%可判定為不存在摻偽。由于0.2 μg/mL 的對照品約相當于5%的馬皮源成分，故擬定馬皮源檢查的參比溶液的限度為0.2 μg/mL。

3.3 樣品質量分析

對婦科止帶膠囊的檢測結果顯示，8 批均未檢出馬皮源成分，說明該品種暫未存在馬皮摻偽投料的情況。本研究建立的方法專屬性強、靈敏度高、準確、高效、簡便，可以有效控制和監管馬皮摻偽投料的不法行為，為含膠類制劑的科學監管和質量控制提供保障。