鹽脅迫對小麥苗期熒光特性的影響及綜合評價

孫 芹，徐學欣，鄧 肖，朱紫鑫，張玉璐，高國龍，蓋紅梅，趙長星

（1青島農業大學農學院/山東省旱作農業技術重點實驗室，山東青島 266109；2青島市農業科學研究院作物研究所，山東青島 266100）

0 引言

土壤鹽漬化是影響全球農田的最嚴重環境壓力之一，給世界各地作物生產帶來了重大挑戰[1]。除自然過程造成的原生鹽堿化外，近年來，由于長期大量施肥、鹽水灌溉和不當灌溉方法等人為活動，農田次生鹽堿化面積迅速增加[2-3]。小麥是國內鹽堿地主要栽培作物之一，年產量約為1.3 億t。選擇和培育能夠在鹽堿條件下生長并產生經濟產量的小麥品種是解決人口、糧食、資源和環境等問題的重要措施[4-5]。

鹽脅迫是影響細胞和植物個體水平生理生化和生長發育過程的非生物因素之一[6]。在鹽脅迫下，植物的酶和非酶抗氧化系統、光合作用系統以及生長發育受到抑制，但脂質過氧化產物增加[7-8]。在生理屬性中植物的光合作用是相當重要的，鹽脅迫通過影響植物對土壤中離子的吸收和運轉，導致光合作用相關指標發生變化[9]。前人研究表明，植物在鹽脅迫下，光合速率、蒸騰速率、氣孔導度均顯著下降[10]。在大多數作物中，植物的光合特性與植物生長和最終產量呈正相關[11]。鹽脅迫在對氣孔特征產生不利影響的同時，也對光系統II(PSII)造成嚴重的損害。PSII 的反應中心是吸收、傳遞并轉化光能的關鍵場所，PSII的功能可以通過測量葉綠素熒光的不同屬性來評估[12]。葉綠素熒光參數能夠反映光合系統“內在性”特點，是光合作用的有效探針[13-15]。鹽脅迫下的植物狀態變化可以通過生物化學信息傳達，但破壞性生物化學分析不允許實時監測，而葉綠素熒光分析能有效地評估生理變化，是快速、實時地篩選麥類作物耐鹽性的方法[16]。

不同品種的耐鹽機制不同，僅從單一指標來評價小麥耐鹽性具有片面性。目前在篩選耐鹽小麥材料時進行綜合耐鹽性評價的較少。筆者以4 份小麥為材料，分析鹽脅迫下小麥幼苗生長發育、光合特性、熒光參數以及MDA和脯氨酸含量的變化特點，研究比較4份小麥苗期的耐鹽性，并通過主成分分析及隸屬函數法對小麥的生長及生理生化指標進行綜合評價，發掘高抗性的小麥資源，以期為小麥耐鹽育種和培育提供科學理論依據和基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年9月—2020年3月在青島農業大學溫室進行。試驗采用4 個小麥品種包括‘冀麥32’（河北省中捷農場農科所）、‘泰農18’（魯農審2008056號）、‘德抗961’（魯農審2001036）、‘師欒02-1’（國審麥2007016）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 將籽粒飽滿、大小一致的小麥種子用3%H2O2消毒15 min，再用蒸餾水反復沖洗3次。放置于鋪有濾紙的發芽盒中，在光照培養箱中培養6天后，選取長勢一致的幼苗，移植于帶有圓孔的泡沫板上，放置于塑料方盒中用霍格蘭氏(Hoagland)全營養液培養，培養條件為溫室，相對濕度65%、光照周期13 h/11 h（白天/夜晚），晝夜溫度為25℃/12℃，光合通量密度(PPFD)為20000 lx。待小麥生長至三葉一心進行鹽脅迫處理，NaCl 脅迫濃度為0、100、200 mmol/L，每個處理6次重復，試驗期間每3天換一次營養液，脅迫7天后進行指標測定。

1.2.2 生長指標 于幼苗鹽脅迫處理后第7 天，每重復用直尺測量10株小麥株高。于幼苗鹽脅迫處理后第7天，用濾紙吸干根部表面水分，用分析天平稱取小麥根部及葉莖部分鮮重并記錄，每個處理進行3 次重復。根系形態指標測定，采用臺式掃描儀(Epson Experssion 10000XL)將幼苗根系圖像分別掃描并存入電腦，利用Win-RHIZO 根系分析系統(Regent Instruments Inc，Canada)對圖像進行分析，獲得總根長、總根表面積、平均根系直徑、總根體積。

1.2.3 光合特性 于幼苗鹽脅迫處理后第7 天，采用便攜式光合系統(Li-6800，USA)在上午9:00—11:00進行凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)等光合特性的測定。選取小麥的最新展開葉進行測定，每個處理重復3次，每重復隨機選取3片長勢一致的葉片。

1.2.4 葉綠素熒光參數 使用調制熒光成像系統Mini-IMAGING-PAM（WALZ，德國）測定小麥幼苗的葉綠素熒光參數。葉片暗適應30 min 后，測定小麥葉片PSII最大光化學效率(Fv/Fm)、PSII實際光化學量子效率(ΦPSII)、光化學猝滅系數(qP)、非光化學猝滅系數(NPQ)。選取小麥的最新展開葉進行測定，每個處理重復3次，每重復隨機選取3片長勢一致的葉片。

1.2.5 MDA含量和脯氨酸含量MDA含量測定采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒，使用INFINITE 200 PRO（瑞士Tecan產）酶標儀。稱取0.1 g小麥鮮樣加入1 mL 提取液進行冰浴勻漿，8000 r/min 4℃離心10 min，取0.2 mL上清液于2 mL離心管中，加入試劑，放置100℃水浴中保溫60 min，冷卻后10000 r/min 常溫離心10 min，取上清至1 mL 玻璃比色皿中，于450、532、600 nm下測定吸光度值。

脯氨酸含量測定采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒，使用INFINITE 200 PRO（瑞士Tecan 產）酶標儀。稱取0.1 g小麥鮮樣加入1 mL提取液進行冰浴勻漿，沸水浴震蕩提取10 min 后，10000 r/min 常溫離心10 min，取0.2 mL上清液于2 mL離心管中，加入試劑，放置沸水浴中保溫30 min，每10 min震蕩1次，冷卻后加入1 mL甲苯，震蕩30 s，靜置片刻，取0.8～1 mL上清于1 mL玻璃比色皿中，于520 nm下測定吸光度值。

1.3 耐鹽性綜合評價

根據文獻[17-18]，計算綜合指標的隸屬函數值、權重值和耐鹽綜合評價D值，計算如式(1)～(4)。

式中，α為單項指標耐鹽系數。U(Xij)為第i個材料第j個綜合指標的隸屬函數值，Xij表示第i個材料第j個綜合指標值，Xjmin表示該綜合指標最小值，Xjmax表示該綜合指標最大值。wj表示第j個綜合指標在所有綜合指標中的重要程度，即權重。Pj表示第j個綜合指標貢獻率，綜合指標和貢獻率由主成分分析法獲得。D為各材料在鹽脅迫條件下用綜合指標評價的耐鹽度量值，D是純數值，其范圍為[0,1]，使材料之間的耐鹽性具有可比性，D值越大耐鹽性越強[19]。

1.4 數據分析

數據整理利用Excel 2007進行，用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析、相關性分析以及主成分分析，用Origin Pro9作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl處理對小麥幼苗生長特性的影響

如表1 所示，隨NaCl 濃度增加，各品種小麥的葉鮮重、根鮮重、總根長、總根表面積和總根體積呈下降趨勢；‘師欒02-1’、‘冀麥32’和‘泰農18’的根直徑呈上升趨勢。在100、200 mmol/L NaCl處理下，‘冀麥32’的葉鮮重顯著高于‘師欒02-1’和‘泰農18’，‘泰農18’的總根長和總根表面積顯著高于‘冀麥32’和‘德抗961’；‘冀麥32’的根平均直徑顯著高于‘泰農18’和‘師欒02-1’；‘泰農18’的總根體積顯著高于‘冀麥32’。在100、200 mmol/L NaCl 處理下，‘冀麥32’的葉鮮重、根鮮重、總根長較對照下降最小，‘德抗961’的根表面積較對照下降最小。100 mmol/L NaCl 處理下‘冀麥32’的總根體積較對照下降最小。200 mmol/L NaCl 處理下‘德抗961’的總根體積較對照下降最小。

表1 不同濃度NaCl處理下小麥生長特性

2.2 不同濃度NaCl處理對小麥幼苗光合特性的影響

如圖1所示，隨NaCl濃度增加，各品種小麥的Pn、Tr、Gs呈下降趨勢，Ci呈上升趨勢。在100、200 mmol/L NaCl 處理下，‘冀麥32’的Pn顯著高于‘師欒02-1’。100 mmol/L NaCl處理下，‘泰農18’的Gs顯著高于‘冀麥32’和‘師欒02-1’。在100、200 mmol/L NaCl 處理下，‘師欒02-1’和‘泰農18’的Ci顯著高于‘冀麥32’。200 mmol/L NaCl 處理下，‘冀麥32’的Pn、Tr、Gs較對照下降幅度最小，分別是35.5%、36%、32.3%；‘師欒02-1’的Pn、Tr、Gs較對照下降幅度最大，分別是48%、44.3%、45.7%；在100、200 mmol/L NaCl處理下，‘冀麥32’的Ci較對照上升幅度最小，‘師欒02-1’較對照上升幅度最大。

圖1 不同濃度NaCl處理下小麥光合特性

2.3 不同濃度NaCl處理對小麥幼苗熒光參數的影響

如圖2 所示，隨著NaCl 濃度的增加，各品種小麥的Fv/Fm呈先下降后上升趨勢，ΦPSII和qP呈下降趨勢，而NPQ呈上升趨勢。100 mmol/L NaCl 處理下，‘師欒02-1’的Fv/Fm顯著低于其他3 個品種。100、200 mmol/L NaCl處理下，‘冀麥32’的ΦPSII顯著高于‘師欒02-1’，‘冀麥32’的NPQ顯著高于‘師欒02-1’，各品種小麥間的qP差異不顯著。NaCl 處理下，與對照相比，‘冀麥32’的ΦPSII和qP下降幅度最小，‘師欒02-1’下降幅度最大，‘冀麥32’的NPQ上升幅度最大，‘師欒02-1’上升幅度最小。200 mmol/L NaCl處理下，葉片的ΦPSII和qP與對照相比，‘冀麥32’下降13.5%和10.2%，‘師欒02-1’下降25.9%和16.9%；葉片的NPQ與對照相比，‘冀麥32’上升34.7%，‘師欒02-1’下降20.2%。

圖2 不同濃度NaCl處理下小麥葉綠素熒光參數

2.4 不同濃度NaCl處理對小麥幼苗MDA和脯氨酸含量的影響

如圖3 所示，隨著NaCl 濃度的增加，各品種小麥的MDA 和脯氨酸含量呈上升趨勢。在100、200 mmol/L NaCl 處理下，‘師欒02-1’的MDA 含量顯著高于‘冀麥32’和‘泰農18’，‘冀麥32’的脯氨酸含量顯著高于其余3個品種。200 mmol/L NaCl處理下，與對照相比，‘冀麥32’、‘泰農18’、‘德抗961’和‘師欒02-1’的MDA 含量分別上升136.8%、175.2%、155.7%和233.0%，脯氨酸含量分別上升了169.1%、144.0%、158.8%和104.2%。

圖3 不同濃度NaCl處理下小麥MDA和脯氨酸含量

2.5 小麥苗期各單項指標的抗鹽系數及相關性分析

根據式(1)計算出各單項指標耐鹽系數，由表2 可知，各品種葉鮮重、根鮮重、總根長、總根表面積、總根體積、Pn、Tr、Gs、Fv/Fm、ΦPSII和qP與對照相比有所下降，根平均直徑、Ci、MDA、NPQ和脯氨酸含量有所上升。由于不同品種的各指標變化幅度不同，用單一的指標評價小麥的耐鹽性結果都不相同。通過表3相關性分析可知，各指標之間存在一定的相關性，因此需要對小麥苗期相關指標進行主成分降維分析。

表2 小麥苗期各單項指標的抗鹽系數α值 %

表3 鹽脅迫下小麥相關性分析

2.6 小麥苗期的主成分分析

對鹽脅迫下4份小麥材料的16個指標做主成分分析（表4）。以累計貢獻率達85%且特征值大于1 為原則選擇主成分，選擇5 個獨立的主成分作為小麥材料耐鹽性鑒定的綜合指標。單指標的得分系數絕對值越大，在主成分中的作用就越大[19]。起主要作用的是主成分1 中NPQ、MDA 和葉鮮重，主成分2 中葉鮮重和Pn，主成分3中Ci、Gs和脯氨酸，主成分4中根表面積、根長和總根體積，主成分5中根鮮重、ΦPSll和Tr。

表4 主成分得分系數及貢獻率

2.7 4份小麥材料的綜合評價

根據式(2)得到4份小麥鹽濃度下3個主成分的隸屬函數值。結合3個主成分的貢獻率，根據式(3)計算出5 個主成分的權重，分別為0.493、0.178、0.144、0.097、0.088。利用式(4)計算出4份小麥材料在鹽脅迫下的綜合評價值(D)。根據D值對供試材料苗期耐鹽性進行排序（表5），4份小麥材料在鹽脅迫下耐鹽性由強到弱為‘冀麥32’、‘德抗961’、‘泰農18’、‘師欒02-1’。

表5 小麥苗期的綜合指標值、權重、隸屬函數值、D值及綜合評價

3 討論

植物的生長發育狀況是反映植物受到脅迫后最直觀可靠的指標。鹽脅迫抑制植物的生長，長期遭受鹽害脅迫會導致植物死亡[20-21]。本試驗中，100、200 mmol/L NaCl 脅迫均抑制了4 個小麥幼苗根莖的生長，顯著降低了葉鮮重和根鮮重，且不同品種間下降幅度不同。在2 個鹽濃度下，‘師欒02-1’根鮮重和葉鮮重比其余3 個品種降低最多，說明‘師欒02-1’對鹽脅迫響應最差。Tian等[22-23]研究表明，鹽分脅迫抑制了花生根系生長，降低了總根體積、總根長和根表面積，然而根平均直徑幾乎不受鹽分脅迫的影響。本研究發現，隨著鹽濃度增加各品種的總根長、總根體積和總根表面積均下降，根平均直徑卻有所增加，原因是中高鹽脅迫抑制了總根長和總根表面積生長，根系依靠根直徑的增加吸收養分水分，這與黃玲等[24]研究的結果一致。

植物葉片的光合能力是決定作物產量的關鍵因素，高鹽脅迫下光合作用受到破壞并導致其他生理代謝發生變化[25]。一般認為，鹽脅迫下植物光合速率下降是由于氣孔調節和非氣孔調節引起的[26]。本研究中，隨著鹽濃度增加各品種的Tr和Gs均下降，而Ci上升，說明在中高鹽濃度下小麥葉片Pn的下降主要是由非氣孔因素引起的。‘師欒02-1’在200 mmol/L NaCl脅迫下Pn和Tr較低，Ci較高，這可能是其耐鹽性弱的重要原因。‘冀麥32’能在鹽脅迫下保持較高的Pn，且Pn、Tr和Gs下降幅度相對于其他品種較小，說明‘冀麥32’在鹽脅迫下光合機構損傷較小，耐鹽性較強。這與張浩等[27]的研究結果一致。

葉綠素熒光參數能夠直接反映光合作用的實際及最大光合效率、反應中心開放程度和植物熱耗散等情況[28-29]。Fv/Fm是快速葉綠素熒光的參數之一，植物中的Fv/Fm有效地響應NaCl、PEG、光和重金屬脅迫[30]。本研究中4 個品種的Fv/Fm在100 mmol/L NaCl 脅迫下顯著下降，表明中度鹽脅迫致使PSII潛在活性中心受損，PSII 的光化學轉化效率降低，植株受到光抑制[31]。在200 mmol/L NaCl脅迫下Fv/Fm降低不明顯，原因是高鹽破壞了光化學反應中的PSII 能力，與Abdeshahian[12]研究的結果一致。本研究中，隨著鹽濃度的增加各小麥品種的ΦPSII和qP降低，NPQ升高，表明鹽脅迫導致小麥光化學中的PSII 吸收的光子程度降低，光子能量轉換為化學能的能力下降，最終導致植物凈光合速率下降[32]，而過多的能量會通過增加NPQ途徑（如葉黃素循環）消散，以緩解鹽脅迫對光合作用的影響[11]。

MDA是膜脂過氧化的產物，其含量是反映細胞膜脂過氧化作用和質膜破壞程度的重要指標，MDA含量越高，質膜傷害程度越大[33]。前人研究表明，鹽脅迫下脯氨酸通過減少有毒離子的吸收來緩解細胞的滲透脅迫，在鹽脅迫條件下積累較高水平脯氨酸的小麥基因型被歸類為耐鹽小麥[34-35]。本研究中不同濃度鹽脅迫下各小麥品種的MDA和脯氨酸含量均不同程度高于對照，‘冀麥32’和‘德抗961’的MDA 升高幅度較小，說明‘冀麥32’和‘德抗961’相對于其他2個品種膜損傷程度較輕，受到鹽脅迫傷害小，‘冀麥32’的脯氨酸含量最高，說明相對于其他品種‘冀麥32’合成更多的脯氨酸以維持滲透勢平衡，從而減輕鈉離子毒性對小麥造成的傷害。

前人鑒定植物耐鹽性時通常使用單一類別的指標進行鑒別，但是植物耐鹽機制是復雜多樣性的，單一指標無法準確評價植物的耐鹽性[36-37]。因此，用多個類別指標來綜合評價小麥耐鹽性才更真實客觀。本研究對鹽脅迫下小麥苗期的生長指標、光合指標、熒光參數以及MDA 和脯氨酸含量通過主成分分析進行降維，結合主成分分析與隸屬函數法計算4份小麥材料的綜合評價D 值，4 份小麥材料鹽脅迫下耐鹽性由強到弱依次為‘冀麥32’、‘德抗961’、‘泰農18’、‘師欒02-1’，該耐鹽強弱順序與4份小麥材料生長指標的表現基本一致，該評價方法具有可行性。另外，本研究中選擇了4個小麥品種進行鑒定，品種較少，今后應該選用更多的品種進行耐鹽性鑒定，同時加入產量指標，篩選出供小麥耐鹽育種的種質資源或直接用于小麥生產的高耐鹽性品種。

4 結論

不同小麥材料對鹽脅迫的生長和生理響應不同，鹽脅迫下‘冀麥32’和‘德抗961’表現出更高的誘導PSII和調節NPQ的能力，以防止脂質過氧化和光合速率下降。因此，這些穩定的生理功能導致幼苗生長更好，具有更強的耐鹽性。