HPLC 法測定保健食品B 族維生素片中9 種維生素B 的含量

譚婉清，王術(shù)玲 ，關(guān)日晴

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510663）

水溶性維生素是人體維持正常生理功能所必需的一類微量有機(jī)物質(zhì)，適量攝取對人的生長、代謝、發(fā)育都具有積極的促進(jìn)作用[1?4]，而過量攝入?yún)s會造成嚴(yán)重危害，如過量攝入維生素B6會對神經(jīng)產(chǎn)生較大的不良影響，導(dǎo)致一些神經(jīng)毒素的產(chǎn)生，并大幅度影響人們的肢體感官；維生素B1的大量使用會對人體的諸多新陳代謝環(huán)節(jié)產(chǎn)生很大的影響，最終導(dǎo)致人體產(chǎn)生頭暈、惡心、心律失常、眼花等現(xiàn)象；維生素B12的過量使用也會導(dǎo)致人體另一種營養(yǎng)素葉酸的缺乏，同時導(dǎo)致心臟病患者病情的進(jìn)一步加重[5]。由此可見，需要科學(xué)、合理地控制維生素的攝入量。

隨著食品工業(yè)的發(fā)展和人們對保健食品需求程度的日漸提高，市場上出現(xiàn)了各類添加維生素B 的保健食品，雖然已引起了質(zhì)量監(jiān)督部門極大的重視，但目前我國針對此類商品功效成分檢測的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6?8]并未完善，在實際應(yīng)用中只能參考食品標(biāo)準(zhǔn)或藥典[9?16]。其中，GB/T 5009.197-2003 在流動相中加入對柱效及泵損害較大的離子對試劑；GB 5009.84-2016 用到氣味較大的正丁醇，前處理需要繁瑣的衍生化，并且測定時受衍生產(chǎn)物在4 h 內(nèi)穩(wěn)定的限制；食品標(biāo)準(zhǔn)中測定煙酸、煙酰胺、葉酸、泛酸和生物素的仲裁法為微生物法，該方法普遍存在操作繁瑣、測定時間長、測定誤差大、測定結(jié)果重復(fù)性差等不足。這些方法并不適用于基質(zhì)相對簡單的保健食品，會降低待測組分的回收率。近年來，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢出限低，準(zhǔn)確度高，備受科研人員的青睞[17?20]，但是質(zhì)譜儀器價格較貴、日常維護(hù)費用也很高，很難在基層普及，另外，對于常量的維生素而言，容易污染儀器，造成儀器殘留。文獻(xiàn)報道[21?24]，用普通高效液相色譜法測定維生素B 的并不少，但覆蓋維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺、泛酸、葉酸、生物素和維生素B12這9 種常見成分進(jìn)行含量測定的研究尚未見報道。

本研究旨在建立一種簡便、快速、準(zhǔn)確的高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）檢測方法，適用于保健食品B 族維生素片中9 種維生素B 成分的含量測定，以期提高檢測分析效率，并降低檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

10 批B 族維生素片 9 批來自2018～2019 年保健食品監(jiān)督抽驗樣品，1 批來自2017 年保健食品委托檢驗樣品；9 種維生素標(biāo)準(zhǔn)品：維生素B1（純度為97.9%）、維生素B2（純度為98.2%）、維生素B6（純度為98.2%）、煙酸（純度為99.8%）、葉酸（純度為89.3%）、泛酸鈣（純度為96.8%）、生物素（純度為99.5%）、維生素B12（純度為90.5%） 中國食品藥品檢定研究院；煙酰胺 純度為99.5%，Dr.Ehrenstorfer GmbH；甲醇 色譜純，霍尼韋爾國際公司；水 超純水；其他試劑為分析純 廣州化學(xué)試劑廠。

Agilent 1260 高效液相色譜儀-二極管陣列檢測器 美國安捷倫公司；CPA224S 萬分之一電子天平德國賽多利斯集團(tuán)；XS205DU 十萬分之一電子天平 梅特勒-托利多集團(tuán)；KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli Q Advantage with A10 超純水發(fā)生器 默克密理博公司；LD5-2B離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液 酸性儲備液：精密稱取維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸和煙酰胺各20 mg于100 mL 容量瓶中，加適量0.1%鹽酸，60 ℃超聲（功率500 W，頻率40 kHz）溶解，約10 min，放置至室溫，用0.1%鹽酸定容至刻度，搖勻，即得各成分濃度為200 μg/mL 的酸性混合儲備液。

堿性儲備液：精密稱取20 mg 葉酸于100 mL 容量瓶中，用0.3%氨溶液溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為200 μg/mL 的堿性儲備液。

中性儲備液：精密稱取維生素B1210 mg 于50 mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得200 μg/mL 的維生素B12對照液。精密稱取泛酸20 mg 和生物素10 mg 于100 mL 容量瓶中，精密移取上述200 μg/mL 的維生素B12對照液20 mL 至此100 mL 容量瓶中，再加適量水，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得泛酸濃度為200 μg/mL、生物素濃度為100 μg/mL、維生素B12濃度為40 μg/mL 的中性混合儲備液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸和煙酰胺的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取上述酸性混合儲備液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 分別至20、20、10、10、10、10 mL 的容量瓶中，用0.1%鹽酸稀釋至刻度，即得維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸和煙酰胺的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.45 μm 的水相微孔濾膜過濾，備用。

葉酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取上述堿性儲備液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 分別至20、20、10、10、10、10 mL 的容量瓶中，用0.3%氨溶液稀釋至刻度，即得葉酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.45 μm 的水相微孔濾膜過濾，備用。

維生素B12、泛酸和生物素的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：精密吸取上述中性混合儲備液0.1、0.5、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 分別至20、20、10、10、10、10 mL 的容量瓶中，用水稀釋至刻度，即得維生素B12、泛酸和生物素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)0.45 μm 的水相微孔濾膜過濾，備用。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析，分別以9 種維生素B 的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制系列標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到9 種維生素B 的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程。

1.2.2 樣品的前處理

1.2.2.1 維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、煙酰胺 稱取混合均勻樣品0.1 g 至于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入0.1%鹽酸10 mL（個別樣品超曲線范圍進(jìn)行適當(dāng)稀釋），搖勻，60 ℃超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理15 min，中途振搖一次，冷卻至室溫，搖勻，靜置或離心（4000 r/min 離心10 min），上清液經(jīng)0.45 μm 的水相微孔濾膜過濾，即得。

1.2.2.2 葉酸 稱取混合均勻樣品0.5 g 至于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入0.3%氨水10 mL，搖勻，60 ℃超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理15 min，中途振搖一次，冷卻至室溫，搖勻，靜置或離心（4000 r/min 離心10 min），上清液經(jīng)0.45 μm 的水相微孔濾膜，即得。

1.2.2.3 泛酸、生物素、維生素B12稱取混合均勻樣品1 g 至于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入超純水10 mL，搖勻，60 ℃超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理15 min，中途振搖一次，冷卻至室溫，搖勻，靜置或離心（4000 r/min 離心10 min），上清液經(jīng)0.45 μm的水相微孔濾膜過濾，用于測定生物素與維生素B12，稀釋10 倍用于測定泛酸。操作過程應(yīng)避免強(qiáng)光照射。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：COSMOSIL C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流速：0.5 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測波長：泛酸和生物素：205 nm，維生素B1、維生素B2、煙酸和煙酰胺：256 nm，維生素B6和葉酸：287 nm，維生素B12：361 nm；檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；流動相：A 為甲醇，B 為0.1 mol/L 的磷酸二氫鉀，梯度洗脫：0.00～8.00 min，A 由5%遞增至20%，8.00～8.01 min，A 由20%快速增至55%，8.01～16.00 min，A 保持55%，16.00～17.00 min，A 由55%遞減至5%，17.00～28.00 min，A 保持5%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

方法學(xué)考察中重復(fù)性平行測定6 份，回收率測定三組9 份，適用性樣品測定2 份，采用Microsoft Office Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均數(shù)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑的選擇

保健食品B 族維生素片基質(zhì)相對簡單，其中的9 種維生素B 成分均為水溶性維生素，但化學(xué)結(jié)構(gòu)并不相關(guān)，理化性質(zhì)和色譜行為差異較大，所以要在同一個溶劑下同時測定B 族維生素片的9 種成分比較困難。維生素B12易溶于水和乙醇，在強(qiáng)酸（pH＜2）和堿性溶液中易分解，導(dǎo)致其檢測結(jié)果偏低[25?26]。維生素B1在酸性條件下穩(wěn)定，在中性和堿性中穩(wěn)定性差[27]。維生素B2、泛酸在堿性條件下不穩(wěn)定，葉酸和泛酸在酸性條件下不穩(wěn)定[28]。維生素B6在空氣與酸性溶液中穩(wěn)定，但在堿性溶液中易被破壞[29]。因此，本實驗用酸溶液提取測定維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸和煙酰胺；用堿溶液提取葉酸；用水提取泛酸、生物素和維生素B12，以確保樣品中的成分穩(wěn)定，結(jié)果可靠。

本實驗比較了鹽酸含量為0.05%、0.1%、0.3%和0.5%對樣品提取的影響，經(jīng)試驗，維生素B1隨著鹽酸含量增加，出峰時間提前，0.3%鹽酸提取液中維生素B1開始有干擾（見圖1），維生素B2、維生素B6和煙酰胺用0.1%鹽酸提取比用0.05%鹽酸提取效果稍好些，所以選用了0.1%鹽酸作為維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸和煙酰胺的提取液。參照《中華人民共和國藥典》（二部）葉酸“含量測定”項，葉酸用0.3%氨溶液作為提取溶劑。

圖1 不同含量鹽酸提取樣品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatograms of samples extracted with different contents of hydrochloric acid

2.2 提取條件的選擇

比較了20、30、40、60 ℃各超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理15 min 的樣品中各成分的響應(yīng)值，以20 ℃測得的響應(yīng)值為基底，折算出20、30、40、60 ℃的相對峰面積（相對峰面積=不同溫度提取的峰面積/20 ℃提取的峰面積×100），繪制柱形圖，總的來說60 ℃條件下提取相對較好。再比較60 ℃超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理15、30、45、60 min 的樣品中各成分的響應(yīng)值，以15 min 測得的響應(yīng)值為基底，折算出15、30、45、60 min 的相對峰面積（相對峰面積=不同超聲時間提取的峰面積/15 min 提取的峰面積×100），繪制柱形圖，結(jié)果顯示差異不明顯，所以確定提取條件為60 ℃超聲15 min，見圖2。

圖2 不同溫度（A）和不同超聲時間（B）的提取效果比較Fig.2 Comparison of extraction effects at different temperatures (A) and ultrasonic time (B)

2.3 流動相的選擇

高效液相色譜法測定維生素B 的標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)中很多用到了離子對試劑，離子對試劑平衡時間長，而且對柱子壽命影響比較大，所以本研究不考慮離子對試劑。參考標(biāo)準(zhǔn)，遴選出流動相中可以添加乙酸鈉和磷酸二氫鉀，本實驗對乙腈-水、甲醇-水、甲醇-乙酸鈉（0.05 mol/L）、甲醇-磷酸二氫鉀（0.01 mol/L）、甲醇-磷酸二氫鉀（0.05 mol/L）和甲醇-磷酸二氫鉀（0.1 mol/L）不同流動相進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示甲醇-乙酸鈉（0.05 mol/L）體系中在205 nm 波長下基線波動大，不利于泛酸和生物素的測定，乙腈-水和甲醇-水體系中有些成分難以被洗脫，甲醇-0.1 mol/L 磷酸二氫鉀體系的分離效果最好，為本實驗的最終流動相，見圖3。

圖3 不同流動相體系下20 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution under different mobile phase systems

2.4 流速與柱溫的選擇

固定柱溫為28 ℃，比較了0.5、0.8、1.0 mL/min的出峰情況，實驗結(jié)果顯示，0.5 mL/min 的條件下，葉酸和維生素B12的分離效果最好，其他成分之間的分離度都大于2，所以選用0.5 mL/min。分離度見表1。

表1 不同流速和柱溫的分離度Table 1 Resolution of different flow rates and columm temperatures

在0.5 mL/min 的條件下，比較了柱溫分別為20、25、30、35 ℃的出峰情況，實驗結(jié)果顯示，溫度越低，葉酸和B12的分離度越大，20、25、30、35 ℃溫度下葉酸和B12的分離度分別為2.60、2.30、2.01、1.69，但泛酸和煙酰胺20 ℃時的分離度為1.95＜2，所以選用25 ℃。分離度見表1。

2.5 波長的選擇

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)C18柱分離后，由二極管陣列檢測器于190～550 nm 波長范圍內(nèi)掃描，獲得各化合物的吸收光譜圖，維生素B1的光譜在242 nm 處有強(qiáng)吸收峰，維生素B2的光譜在266 nm 處有強(qiáng)吸收峰，煙酸、煙酰胺的光譜在260 nm 處有強(qiáng)吸收峰，維生素B6的光譜在290 nm 處有強(qiáng)吸收峰，葉酸的光譜在284 nm 處有強(qiáng)吸收峰，維生素B12的光譜在361 nm處有強(qiáng)吸收峰，泛酸和生物素沒有明顯的強(qiáng)吸收峰，參考GB/T 22246-2008[7]在200 nm 處測定泛酸，GB/T 17778-2005[30]在210 nm 處測定生物素，為兼顧多種組分的同時檢測，并綜合考慮靈敏度等因素，泛酸和生物素的檢測波長為205 nm，維生素B1、維生素B2、煙酸、煙酰胺的檢測波長為256 nm，維生素B6和葉酸的檢測波長為287 nm，維生素B12的檢測波長為361 nm，標(biāo)品的檢測結(jié)果見圖4。

圖4 20 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatograms of 20 μg/mL mixed standard solution

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 方法的線性及方法檢出限濃度 在試驗條件下，對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定。結(jié)果表明9 種維生素B 均在各自線性范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)R2均大于0.999。取維生素B 的標(biāo)準(zhǔn)品，以信噪比（S/N）3～5 配制檢出限溶液，按本方法最大取樣量1 g，最小稀釋倍數(shù)10，計算檢出限（LOD）。見表2。

表2 9 種維生素B 的線性回歸方程、線性關(guān)系和LODTable 2 Linear regression equation,correlation coefficient and LOD of 9 kinds of vitamin B

2.6.2 重復(fù)性 煙酰胺是煙酸的酰胺化合物，通常不會同時添加在同一樣品中，所以通過樣品1 和樣品2 來完成9 種成分的重復(fù)性試驗。在相同的儀器條件下，按照1.2.2 實驗步驟，分別測得樣品1 中維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6、葉酸、泛酸、生物素及維生素B12的含量，按照1.2.2.1 實驗步驟，分別測得樣品2 中煙酸的含量，結(jié)果表明重復(fù)性良好，其RSD 見表3。

表3 9 種維生素B 的重復(fù)性和穩(wěn)定性（n=6）Table 3 Repeatability and stability of 9 kinds of vitamin B (n=6)

2.6.3 穩(wěn)定性考察 在相同的儀器條件下，對同一混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（20 μg/mL）進(jìn)行0、1、2、4、8、16、24、36、48 h 進(jìn)樣測定，可以看出9 種維生素B 保留時間穩(wěn)定，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）≤0.8%（n=9），結(jié)果表明，維生素B 族9 種成分48 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好，其RSD 見表3。

2.6.4 方法回收率 通過樣品1 和樣品2 來完成9 種成分的回收試驗。精密稱取9 份同批次樣品1，按樣品各成分含量約80%、100%、120%高中低三個水平加入各標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平各3 份樣品，按照1.2.2 實驗步驟，分別測得樣品1 中三個水平的維生素B1、煙酰胺、維生素B2、維生素B6、葉酸、泛酸、生物素及維生素B12的濃度并計算回收率，精密稱取9 份同批次樣品2，按樣品煙酸含量約80%、100%、120%低中高三個水平加入煙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平各3 份樣品，按照1.2.2.1 實驗步驟，測得樣品2 中三個水平的煙酸濃度并計算回收率。結(jié)果顯示平均回收率為91.8%～106.9%，RSD 為0.2%～4.8%，可以滿足維生素B 族9 種成分的檢測要求，各回收率及RSD 見表4。

表4 9 種維生素B 的回收率Table 4 Recoveries of 9 kinds of vitamin B

2.6.5 適用性 為考察方法的普遍適用性，采用本試驗方法，對收集的9 個品種10 批次B 族維生素片樣品進(jìn)行檢測，并與檢驗標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法測定結(jié)果進(jìn)行比較，2 號和3 號樣品的檢驗標(biāo)準(zhǔn)并沒有對維生素B6、葉酸、泛酸及維生素B12作要求，其它結(jié)果與本方法結(jié)果的相對偏差在允許范圍內(nèi)，表明本方法適用于B 族維生素片中9 種維生素B 的含量測定，見表5。

表5 10 批樣品的維生素B 含量（mg/g）Table 5 Contents of vitamin B in 10 samples (mg/g)

3 結(jié)論

在本研究建立的HPLC 色譜條件下，9 種維生素B 成分能得到較好的分離。線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率等試驗結(jié)果表明，本方法靈敏、快速、準(zhǔn)確，適用于保健食品B 族維生素片中9 種維生素B 的含量測定。與目前的國家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道的方法相比，在保證準(zhǔn)確性好、靈敏度高的同時，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，降低了檢測成本，提高了檢測效率。從實際樣品的測定實驗發(fā)現(xiàn)，個別產(chǎn)品（本實驗中的2、3 號樣品）標(biāo)簽有添加維生素B6、葉酸、泛酸及維生素B12這幾種成分，但企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中并沒有作相應(yīng)的要求，檢驗機(jī)構(gòu)一般按標(biāo)準(zhǔn)檢驗，從而造成監(jiān)管漏洞，該方法可快速測定B 族維生素片中9 種維生素B 成分的含量，尤其適用于大批量的監(jiān)督抽驗，可為該類保健品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供定量依據(jù)，為監(jiān)督B 族維生素類保健食品市場提供保障。