酶及酶技術在茶葉深加工中的應用

費 璠 劉昌偉 牛 麗 劉仲華,3

(1. 湖南大眾傳媒職業技術學院，湖南 長沙 410100；2. 湖南農業大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；3. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128)

茶，作為世界最受歡迎的飲料之一，在全世界60多個國家和地區均有種植[1]。近年來，隨著中國茶園面積和茶葉產量的逐年增加，對茶葉品質要求也越來越高。然而，因夏秋茶滋味偏苦澀，品質相對較低，不少茶區對夏秋茶鮮葉實行棄養、棄采的策略。據調查[2]，中國夏秋茶鮮葉中有30%～40%的已停止采摘，造成夏秋茶資源的極大浪費。夏秋茶具有生長迅速、芽頭肥壯、茶多酚等物質積累多等優點，提質增效潛力大[3]。隨著中國茶園面積的快速擴大，茶葉產量也同步快速增加，如何通過深加工技術提高過剩的茶葉資源(尤其是夏秋茶)利用效益，是推進中國茶產業高質量發展過程中日益突出的問題。

茶葉中的活性成分復雜多樣，部分茶葉活性成分由于自身結構的特點，難以被傳統的提取分離技術高效提取，且穩定性不強、生物利用度低，限制了其應用開發[4]。酶，絕大多數是生物大分子蛋白，在幾乎所有的生物過程中都能高效、特異地加快生物化學反應。酶的催化活性、特異性和選擇性使其在生物催化、生物傳感器和生物醫學等領域具有廣闊的應用前景[5]。隨著生物技術的發展，使用酶制劑開發綠色、可持續生物工藝方面的研究已成為熱點[6]。外源酶被廣泛應用于茶葉深加工領域，可更加綠色、高效的提取、分離、制備或修飾茶葉功能成分，以實現茶葉資源的高效利用。

酶技術在功能成分等茶葉深加工領域的應用主要包括三大部分：酶法提取、酶法合成、生物酶修飾茶葉提取物。酶法提取是利用果膠酶等水解茶葉細胞壁等，破壞細胞結構，促進茶葉內含物質溶出，提高茶葉活性成分的提取率[7]，如茶多酚、兒茶素等物質的提取。酶法合成茶葉有效成分主要研究了利用酶催化合成茶黃素以及酶法合成茶氨酸等。生物酶修飾茶葉提取物可改善其穩定性，提高茶葉提取物的生物利用度，改變茶葉提取物的重要官能團，顯著提高其生物活性[8]。而固定化酶技術是將生物酶固定到一種特殊材料上，從而使酶的穩定性、使用周期等大大增強。固定化酶能夠高效、循環多次地利用于茶葉提取物的加工過程中，大大降低了茶葉深加工的生產成本，降低能耗，提升提取物質量，增加產品的附加值[9]。研究擬從酶法輔助提取、酶法輔助合成、生物酶修飾茶葉提取物以及固定化酶技術等方面對近年來國內外酶技術在茶葉深加工中的應用情況進行綜述，以期為茶葉資源的高效開發與利用提供借鑒。

1 酶法輔助提取

從茶葉中提取兒茶素等活性成分通常是使用熱水浸提，該法能耗較高，且存在部分活性物質難以完全提取或是因加熱而發生異構化/氧化降解等問題，進而大大降低了活性成分的提取效率。茶葉有效成分往往存在于細胞中，因此，能否充分破壞細胞壁是高效提取茶葉有效成分的關鍵。植物的細胞壁主要由纖維素和果膠組成[10]，纖維素酶和果膠酶在一般條件下即可破壞茶葉細胞壁，并在加速內含成分析出的同時，減少香氣物質的損失[11]。此外，酶促反應還能進一步促進芳香物質的生成；而提取過程中，纖維素等多糖類物質的水解使可溶性糖含量增加，從而增進了茶多糖的豐度，還增加了茶多糖的抗氧化效率[12]。使用纖維素酶和果膠酶復合酶提取茶多酚，能夠顯著提升茶多酚浸提率，且得到的茶多酚具有優異的抗氧化性[13]。此外采用復合酶解—回流萃取法制備紅茶提取物，提取效率將進一步提升[14]。茶葉中的酯型兒茶素易與蛋白質等反應形成茶乳酪，造成“冷后渾”[15]。因此在速溶茶的生產中需要除去茶乳酪。武永福等[16]研究發現單寧酶可切斷酯型兒茶素中兒茶素與沒食子酸間的酯鍵，轉化得到簡單兒茶素和一個沒食子酸，減少茶乳酪的形成從而提高茶飲料的澄清度，降低茶湯苦澀度、使速溶茶口感有較大提升。

酶制劑現已被廣泛應用于茶葉深加工中，在提高茶葉附加值的同時，較好地促進了夏秋茶資源的合理利用。目前，酶制劑仍存在成本高、酶活低等問題。但隨著酶工程技術的高速發展，酶技術將推動茶葉提取乃至植物提取行業更加高效健康的發展。

2 酶法輔助合成

2.1 茶黃素酶促合成

茶黃素是由茶葉中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase， PPO)等關鍵酶催化兒茶素氧化合成[17]，是紅茶中的“黃金分子”，具有抗炎、抗氧化等優異的生物活性[18-20]。但紅茶中茶黃素含量偏低，難以分離提取，因此，體外酶法合成是獲取茶黃素的有效途徑。

目前體外模擬氧化合成茶黃素的研究主要集中在酶源篩選方面。現有研究[21]表明，茶鮮葉、梨等植物酶以及微生物酶作為酶源均能有效催化茶黃素的體外合成。于酶源的茶黃素合成系統中[22]，加入底物兒茶素，茶PPO并通氧，在濃度為55 mmol/L的(表兒茶素EC、表沒食子兒茶素EGC、表兒茶素沒食子酸酯ECG、表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG等)兒茶素系統內發酵30 min后，茶黃素較傳統合成方式提高了68%，在發酵系統中底物消耗的順序是EC>EGCG>EGC>ECG[23]。同時，在反應過程中采用分批加料的方式，也能顯著提升茶黃素的產量[24]。Narai-Kanayama等[25]發現，茄子PPO在25 ℃，pH值4.5，底物質量濃度2.5 g/L，35 mL酶(活力196 U)的條件下催化兒茶素反應40 min得到茶黃素7.45 mg。Zhou等[26]以酪氨酸酶Bmtyrc為對象的研究，采用定向進化的方法得到多酚氧化酶，其催化性能明顯優于野生型的突變體蛋白Bmtyrc-3，這種酶對EGCG和ECG的比活力分別提高了6.46倍和4.91倍。使用突變體Bmtyrc-3催化合成TFDG，產率可達35.35 mg/g，具有潛在的工業化應用價值。此外，有研究[27]比較了酪氨酸酶、漆酶、膽紅素氧化酶和茶粗PPO活性，并用其催化合成茶黃素，其中酪氨酸酶催化效率最佳。值得注意的是，雙酶(m梨PPO∶m真菌漆酶=1∶1)合成茶黃素的產率比單一使用梨PPO和真菌漆酶提高了18.4%和12.9%[28]。說明兩種酶可能相互協作，推動兒茶素氧化向著合成茶黃素的方向進行，顯著提升茶黃素合成效率。兩種酶在催化過程中相互補足，最大效率催化茶黃素的合成，這可能是未來的發展方向之一，但雙酶系統也可能產生更多的副產物，相關研究仍需深入探索。

上述研究說明植物氧化酶是一種能夠有效催化合成茶黃素的酶，但由于不同來源的專一性不同，酶活力不足，生產成本高，分離純化困難等因素，使得目前茶黃素酶促合成研究大多處于實驗室研究階段，較少運用于產業化合成。

2.2 茶黃素單體合成

茶黃素單體主要包含4種：茶黃素(Theaflavin，TF)、茶黃素-3-沒食子酸酯(Theaflavin-3-gallate，TF-3-G)、茶黃素-3′-沒食子酸酯(Theaflavin-3′-gallate，TF-3′-G)和茶黃素雙沒食子酸酯(Theaflavin-3，3′-digallate，TFDG)，由于其結構極度相似(圖1)，分離純化難度大[29]。因此，以外源酶催化兒茶素單體定向合成茶黃素并結合色譜等純化方法能夠有效制備茶黃素單體。Teng等[30]從茶鮮葉中純化得到兩種酶(PPO1和PPO2)，并用其與EGC、EGCG等反應，發現PPO1對兒茶素底物更具催化活性，PPO1僅催化TF合成，而PPO2能夠有效催化合成TFDG。但PPO酶提取效率低，難以規模化生產。在未來可通過轉基因技術將茶樹PPO基因轉導于微生物中并使其高表達，規模化產生PPO，專一催化合成茶黃素單體。

圖1 4種茶黃素的結構式

通過培養茶樹細胞得到的PPO酶也可催化EC和EGC有效合成TF，最終合成TF 395 mg，回收率70%[31]。該方法合成茶黃素效率高，但由于反應體系含有其他兒茶素，導致生成其他茶黃素組分，為單體分離純化增加了難度。使用酪氨酸酶在1-辛醇和緩沖液雙相系統中催化合成TF-3-G的產率顯著提升[32]，在酶促反應中EGCG醌優先二聚化，而辛醇相中的自身二聚化被抑制， EGCG醌參與ECO偶聯，從而有效地產生TF-3-G。但由于使用過多的有機試劑，其運用前景還有待探討。吳光亮等[33]利用皇冠梨PPO催化EGCG和ECG合成TFDG，在最優條件下反應60 min后，結合色譜技術分離得到純度為97%的TFDG，得率為85%。但梨中酶含量少且不同產地酶活力差異巨大，此研究目前只停留在實驗室階段，難以運用到TFDG生產中，仍需深入探索。

總之，使用酶催化兒茶素合成茶黃素單體，可降低分離純化茶黃素難度，為茶黃素單體的大規模生產提供可能。而篩選出合適的酶則是該工藝的關鍵步驟，生物酶在催化合成茶黃素及茶黃素單體方面的研究將大有可為。

2.3 茶氨酸合成

L-茶氨酸是茶葉的一種特有氨基酸，是茶葉中重要的品質與功能成分，具有安神鎮靜等多種生物活性，被廣泛應用于食品、保健品等領域[34-36]。因此，L-茶氨酸的市場需求日愈提升。目前制備L-茶氨酸的方法包括：直接從茶中提取分離、化學合成和生物合成等[37]。綜合多方面考慮，生物合成是制備L-茶氨酸最優選擇，其中微生物酶合成是最具潛力的方法。

在大腸桿菌中異源表達γ-谷氨基甲酰胺合成酶和多聚磷酸激酶，并利用重組酶耦聯催化合成L-茶氨酸，成品純度可達到98.51%[38]。以γ-谷氨酰轉肽酶催化合成L-茶氨酸，在500 mL的體系中，添加0.2 mol/L谷氨酰胺，1.8 mol/L乙胺，0.4 mol/L HCl，3 U transferγ-GGT粗酶液、0.06 mol/L NH4HCO3，1 mmol/L Mg2(OH)2CO3，在pH 9.7，30 ℃的條件下，反應36 h，茶氨酸產量為26.45 g/L，底物轉化率可達86%[39]。根據L-茶氨酸合成機制，研究人員[40]從茶樹根際土壤篩選出了具有高產L-茶氨酸能力的優勢菌株。該菌株合成的酶催化合成L-茶氨酸產量達到2.945 g/L。Suzuki等[41]利用γ-谷氨酰胺轉肽酶催化L-谷氨酰胺和乙胺反應生產茶氨酸，轉化率可達60%。反應條件溫和，綠色高效，產物無毒且活性高。然而，由于現有研究受到技術的限制，對高產L-茶氨酸合成酶的菌株篩選、培養與合成酶的高表達及固定化、合成酶催化合成L-茶氨酸等關鍵技術難點尚未取得關鍵性突破，生物酶合成L-茶氨酸，成本高，產品單價高，受到化學合成茶氨酸的沖擊等因素，生物酶催化合成L-茶氨酸仍需更深入的研究。

3 生物酶修飾茶葉提取物

眾多茶葉提取物如EGCG具有結構不穩定、易被氧化、脂溶性差、生物利用度低等缺點[42-46]，這大大限制了茶葉提取物在食品醫藥等領域的開發與利用。因此對茶葉提取物結構進行分子修飾，如酯化、甲基化、酰基化等衍生化已成為解決上述問題的最優辦法之一[47-48]。化學修飾是當前分子改造的主要方法，但仍有一定的局限，而酶法修飾還處在探索階段。使用酶對茶葉天然產物的結構進行修飾，不僅能提高茶葉功能成分的穩定性及生物利用度，還能提升其脂溶性和生物活性，這對茶葉活性物質的運用具有重大意義。

EGCG可用酶除去沒食子酸酯，將其轉化為更具活性的EGC。單寧酶可水解除去茶湯中酯型兒茶素的沒食子酸酯，其自由基清除率和活性顯著提高[49]。近年來，改善EGCG特性的研究主要集中在酶法和化學方法乙酰化或酯化其酚羥基[50]。生物酶修飾EGCG是提升EGCG脂溶性的較優選擇。酶法酰化反應溫和，未引入其他物質，使得產物分離純化更加高效便捷。對EGCG 4個環上的酚羥基進行乙酰化或酯化，使得重構的分子由水溶性變為脂溶性。利用脂肪酶催化EGCG成功轉化4種衍生物，且4種衍生物抗氧化活性均優于EGCG[51-53]。利用酶對兒茶素等進行結構改造，其條件溫和，使得茶葉活性物質生物活性最大化保留。但酶生產成本過高，如何獲取專一高效酶源成為關鍵問題。在未來可利用基因工程與發酵工程培養工程菌種生產兒茶素酯化、酰基化等所需酶制劑[54]，這樣可極大解決酶制劑所存在的問題，為茶葉有效成分修飾提供優質可靠的酶。

4 固定化酶技術

酶是一種可以高效控制特定化學反應的一種通用的生物催化劑。但是，天然酶酶活力低且不穩定難以利用，成本高等因素制約酶制劑的使用。酶固定化后具有穩定性增加，易從反應系統中分離且易于控制，能反復多次使用等優勢[55]，是催化合成茶黃素等茶葉活性成分的理想酶源(圖2)。

圖2 基因重組酶催化合成茶黃素

將茶葉PPO固定在聚苯胺膜中，可增加酶的熱穩定性，其半衰期也遠長于游離酶，使用該酶進行茶黃素合成，總轉化效率達到85%[56]。該酶系統特點是無毒性，易得，催化效率高，但茶PPO提取繁瑣復雜，提取工藝尚待優化。Zeng等[57]使9種物種的PPO基因在大腸桿菌中異源表達得到PPO，并將PPO固定，這些酶均能催化合成茶黃素，且活性更強，能循環使用多次。此類酶可能存在包涵體，酶無催化活性，且成本過高，目前尚處于摸索階段。但該方法無疑是未來酶技術發展的主要方向，突破相關技術難題，未來將大有可為。Lei等[58]通過將梨PPO固定在納米材料上得到固定化酶，并用其催化合成TFDG，產率可達42.23%，顯著提高了合成效率。梨PPO固定化后，酶活性和存儲周期大大增強，使用8次后仍具有85%的酶活力，極大地增強了酶的使用效率。梨PPO是目前合成茶黃素效果最佳的酶，通過該酶有望實現規模化生產茶黃素。

總之，將酶固定化技術應用于茶葉深加工中，能夠大幅提升酶的使用效率促進茶葉有效成分轉化效率，且能夠循環多次使用，具有巨大的應用潛力。目前，雖然固定化酶技術運用于茶葉活性成分提取已有報道，但是固定化酶運用于茶葉深加工僅局限于實驗室層面，難以大量生產高純茶葉活性成分，嚴重阻礙了茶葉天然產物的功效研究和應用開發，酶催化技術值得進一步深入探討。

5 展望

近年來，隨著酶工程和茶葉加工技術的高速發展，酶工程技術在茶葉加工中的研究越來越多。外源酶參與茶葉加工，能夠促進鮮葉中的酯型兒茶素分解，使茶葉中可溶性糖、氨基酸、茶黃素等關鍵品質因子增多，降低茶葉苦澀度，提升夏秋茶品質，還能為發酵茶類縮短加工周期，加速成茶品質形成。在提取茶葉有效成分時，酶制劑能有效破壞細胞結構，增加細胞通透性，促進細胞內物質的溶出、擴散和浸出，達到充分提取的目的。在速溶茶加工中，酶能去除沉淀，提高氨基酸含量賦予茶湯鮮爽的口感，減少香氣的損失，改善茶湯色澤。在酶制劑合成茶葉活性物質時，酶技術能夠特異性催化合成茶黃素等物質，且副產物量少易分離，反應高效綠色環保。但酶工程技術在茶葉領域的應用仍有不足，如酶源受限、生產成本高等。總的來說，酶在茶產業的應用潛力巨大，期望在未來的發展中，結合基因工程、蛋白質工程等通過轉基因技術改良、誘變、馴化等方式培養菌株生產適宜應用于茶產業中的酶，并將酶固定化后更好的應用于生產。