細葉黃皮根總黃酮提取工藝優化及抑菌活性研究

許丹妮 蘇秀芳 黃麗娟

(廣西民族師范學院化學與生物工程學院，廣西 崇左 532200)

細葉黃皮[Clausenaanisum-olens(Blanco.) Merr]為蕓香科黃皮屬植物。據報道，細葉黃皮植物含有香豆素[1]、黃酮類[2]、揮發性成分[3]等，其中黃酮類成分含量較高。蘇秀芳等[4-5]分別從細葉黃皮果仁、葉提取總黃酮，并測定其清除羥自由基活性，表明總黃酮具有較強的清除羥自由基的能力。另外，蘇秀芳等[6]研究發現，細葉黃皮莖皮乙醇提取物具有廣譜的抑菌活性。

為進一步考察細葉黃皮其他部位總黃酮含量，以及不同產地細葉黃皮總黃酮含量及抑菌情況，研究擬優化細葉黃皮根總黃酮的超聲輔助提取工藝，并對廣西崇左市不同地區細葉黃皮根提取物的抑菌活性進行測定，以期為細葉黃皮資源的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

紫外可見分光光度計：UV-1601型，北京瑞利分析儀器公司；

超聲波清洗器：SG2200HPT型，上海冠特超聲儀器有限公司；

立式電熱壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫療器械廠；

隔水式恒溫培養箱：GNP-9270型，上海精寄宏實驗設備有限公司。

1.2 材料

綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)：廣東微生物研究所；

大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、殺螟桿菌(Bacilluscereus)：廣西大學農學院；

蘆丁：生化試劑，上海晶純試劑有限公司；

瓊脂粉、牛肉膏、蛋白胨：廣東環凱微生物有限公司。

1.3 樣品

細葉黃皮于2020年5月采摘于崇左市郊區、扶綏縣東門鎮、寧明縣亭亮鄉、龍州縣響水鎮、天等縣東平鄉、大新縣雷平鎮，經該院植物分類學黃秋嬋教授鑒定為Clausenaanisum-olens。取各產地細葉黃皮根烘干，粉碎，過60目篩備用。

1.4 方法

1.4.1 標準品溶液的制備 準確稱取蘆丁標準品12.50 mg，用60%乙醇溶解并定容，配制成蘆丁標準液0.250 0 g/L。

1.4.2 測定波長的選擇 取1 mL蘆丁標準品溶液，用5% NaNO2水溶液0.4 mL溶解，放置6 min，再用10% Al(NO3)3水溶液0.4 mL溶解，放置6 min，最后用4% NaOH水溶液4.0 mL溶解并定容，室溫放置15 min后，用400～600 nm范圍掃描最大吸收波長，結果在510 nm處有最大吸收峰，以510 nm作為測定波長。

1.4.3 標準曲線的繪制 取5只比色管，分別準確吸取0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL蘆丁標準品溶液，其他步驟同1.4.2，以試劑空白為對照，測定樣品的吸光度。以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：A=9.485 7ρ-0.003 1，R2=0.999 6，在考察范圍內呈良好的線性關系。

1.4.4 單因素試驗 以細葉黃皮根總黃酮得率為考察指標，大新縣雷平鎮細葉黃皮根為原料通過超聲輔助提取法探討不同提取條件對總黃酮得率的影響。

(1) 溫度對總黃酮得率的影響：稱取物料1.000 g，加60%乙醇20 mL，設定功率50 W，超聲提取20 min，濾紙過濾，定容至50 mL，準確吸取1 mL樣品按1.4.3處理，測定吸光度后計算總黃酮得率。探討溫度為30，40，50，60，70，80 ℃對細葉黃皮根總黃酮得率的影響。

(2) 超聲功率對總黃酮得率的影響：稱取物料1.000 g，加60%乙醇20 mL，分別設定超聲功率40，50，60，70，80 W，超聲提取20 min，過濾，定容，準確吸取1 mL 樣品按1.4.3處理，測定吸光度后計算總黃酮得率。

(3) 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響：稱取物料1.000 g，溫度70 ℃，功率60 W，設定乙醇體積分數為40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，分別量取20 mL，提取20 min，過濾，定容，準確吸取1 mL樣品按1.4.3處理，測定吸光度后計算總黃酮得率。

(4) 液料比對總黃酮得率的影響：稱取物料1.000 g，設定溫度70 ℃，功率60 W，乙醇體積分數90%，改變液料比1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24，1∶28 (g/mL)，提取20 min，過濾，定容，準確吸取1 mL樣品按1.4.3處理，測定吸光度后計算總黃酮提取率。

(5) 提取時間對總黃酮得率的影響：稱取物料1.000 g，設定溫度70 ℃，功率60 W，乙醇體積分數90%，液料比1∶24 (g/mL)，改變提取時間為20，30，40，50，60，70 min，過濾，定容，準確吸取1 mL樣品按1.4.3處理，測定吸光度后計算總黃酮得率。

1.4.5 正交試驗 根據單因素試驗結果，選取L9(34)正交表進行試驗設計，優化提取工藝并進行重復性驗證實驗，以最佳工藝條件測定不同產地細葉黃皮根總黃酮得率。

1.4.6 抑菌試驗

(1) 抑菌受試液的制備：分別取崇左市6個不同產地的細葉黃皮根總黃酮，配制成一定濃度受試液。

(2) 菌液的制備：用供試菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，在約37 ℃搖床活化18 h，用10倍稀釋法稀釋菌懸液并進行活菌計數，使最佳菌懸液濃度約為106CFU/mL。

(3) 傾注平板法測定抑菌效果：根據文獻[7]修改如下，用移液槍吸取受試液各2 mL，分別放于直徑約9 cm的無菌空培養皿內，加入預先融化冷卻好的瓊脂培養基，混勻；移取配置好的菌液100 μL，放入相應的培養皿中，均勻涂布，于37～39 ℃恒溫培養，24 h后觀察結果，量出抑菌圈。

1.5 數據分析

試驗數據均為3個平行樣的均值，采用Excel 2010處理數據、繪圖并進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 溫度對細葉黃皮根總黃酮得率的影響 由圖1可知，細葉黃皮根總黃酮得率在30～60 ℃時呈平緩上升趨勢，溫度為70 ℃時總黃酮得率最大，隨后出現下降，推測隨著溫度的增加，分子運動速率增加，加速了黃酮類成分向細胞外的溶出[8]。因此最佳提取溫度為70 ℃。

圖1 溫度對總黃酮得率的影響

2.1.2 超聲功率對細葉黃皮根總黃酮得率的影響 由圖2 可知，在超聲功率為50 W時細葉黃皮根總黃酮得率達到最大值，而后逐漸下降，可能是由于受到“空化作用”[9]的影響，某些黃酮類物質結構受到破壞，因而影響總黃酮得率。因此最佳提取功率為50 W。

圖2 超聲功率對總黃酮得率的影響

2.1.3 乙醇體積分數對細葉黃皮根總黃酮得率的影響

由圖3可知，細葉黃皮根總黃酮得率隨乙醇體積分數的增加呈先升高后降低的趨勢，當乙醇體積分數為90%時得率最高，達3.1%。這可能是隨著乙醇體積分數的增加，有其他雜質溶出并與乙醇—水分子結合，導致總黃酮得率降低[10]。因此最佳提取的乙醇體積分數為90%。

圖3 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

2.1.4 料液比對細葉黃皮根總黃酮得率的影響 由圖4可知，細葉黃皮根總黃酮得率在料液比為1∶24 (g/mL)時達到最大值3.12%，推測溶劑量增加，在超聲作用下料液之間混合較充分，同時使植物細胞破裂，溶劑迅速進入細胞內，促使黃酮類化合物不斷溶出，直至達到飽和。因此最佳提取的料液比為1∶24 (g/mL)。

圖4 料液比對總黃酮得率的影響

2.1.5 提取時間對細葉黃皮根總黃酮得率的影響 由圖5 可知，細葉黃皮根總黃酮得率隨提取時間的增加先增加后降低并趨于平緩，當提取時間為40 min時得率達到最大值，為3.17%。推測在合適的提取時間范圍，超聲波能促進總黃酮類成分的溶出，而隨提取時間的延長，總黃酮類成分溶出完全，同時有可能溶出的黃酮類化合物反而被超聲所破壞，導致總黃酮得率下降[11]。因此最佳提取時間為40 min。

圖5 提取時間對總黃酮得率的影響

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗因素 正交試驗因素水平設計見表1，試驗結果與極差分析見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交試驗因素水平表

由表2和表3可知，細葉黃皮根總黃酮得率的主次影響因素為料液比>超聲功率>提取時間>乙醇體積分數(C>B>D>A)，其中料液比、超聲功率對總黃酮得率具有顯著性影響；最佳提取工藝條件為A2B2C1D2，即乙醇體積分數90%，超聲功率50 W，料液比1∶16 (g/mL)，提取時間40 min。

表2 試驗結果與極差分析

表3 方差分析結果?

2.2.2 驗證實驗 準確稱取3份試樣，按最佳提取工藝條件提取，總黃酮得率分別為3.346%，3.380%，3.356%，平均值為3.361%，表明此工藝重復性好，具有可行性。

2.3 不同產地細葉黃皮根提取物得率比較

稱取各個產地的細葉黃皮根1.000 g，按最佳提取工藝提取，結果見表4。由表4可知，崇左市區細葉黃皮根皮提取總黃酮得率最高，其次是大新縣雷平鎮。

表4 不同產地總黃酮的得率

2.4 不同產地細葉黃皮根提取物抑菌活性比較

取不同產地細葉黃皮根提取物，低溫回收溶劑后，低溫烘干后加入二甲亞砜(經試驗表明其對供試菌無抑制作用)，配成質量濃度100 mg/mL，為受試液，進行抑菌試驗，結果見表5。

表5 不同產地細葉黃皮總黃酮抑菌圈直徑

由表5可知：不同產地細葉黃皮根提取物對5種菌均有一定的抑制作用，不同產地提取物的抑菌效果不同，但同一產地的提取物對5種菌的抑制效果差異不明顯。整體分析6個產地中崇左市區、大新縣雷平鎮細葉黃皮根提取物抑菌作用相對較強，次之為龍州縣響水鎮，天等縣東平鄉、寧明細葉黃皮提取物抑菌效果相對較弱。其原因可能是不同產地細葉黃皮根提取物的總黃酮含量不同，影響了其對5種試驗菌的抑制作用。

3 結論

通過超聲輔助提取細葉黃皮根總黃酮得率為3.361%，不同產地細葉黃皮根總黃酮提取得率有差異，崇左市區細葉黃皮根皮總黃酮得率達4.781%，其次是大新縣雷平鎮總黃酮得率為3.361%，超聲波輔助提取法簡便、省時，適合用于細葉黃皮根總黃酮的提取，推測不同產地，不同土壤、不同氣候環境對細葉黃皮根總黃酮得率有一定的影響，而不同產地細葉黃皮根或根皮總黃酮對桿菌類(綠膿、枯草、殺螟、大腸)及金色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌廣譜，且不同產地抑菌效果不同。綜合分析，細葉黃皮利用價值高，應對各產地相同部位的有效成分及生物活性等進一步深入研究，篩選出最佳的產地并進行大量種植，使其在食品行業中發揮更廣的作用。