GC-MS法測定保健食品中他汀類藥物含量的不確定度評定

張麗霞 郭慶園 華啟誠 李向梅

(1. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510000；2. 清遠海關綜合技術服務中心，廣東 清遠 511515；3. 廣州海關技術中心，廣東 廣州 510000)

他汀類物質是減肥類保健食品中常檢出的非法添加化合物[1]。其作用機理是通過阻斷羥甲戊酸的代謝途徑，增加細胞膜表面低密度脂蛋白受體的活性，致使血清中膽固醇被加速清除，從而達到降脂減肥的效果[2-3]。但過量食用他汀類化合物不僅會引發橫紋肌溶解等肌肉類疾病[4]還會導致急性腎衰[5-6]。常見的非法添加他汀類物質包括洛伐他汀、美伐他汀及辛伐他汀等[7-8]。

目前，國家市場監督管理總局規定的他汀類物質檢測方法為提取食品中的他汀類物質后直接用LC-MS/MS進行測定[9]，該方法未涉及樣品測定前的凈化步驟。孫麗萍等[10]將提取后的他汀類樣品直接進行HPLC測定然后評定該方法的合成不確定度，結果表明重復性分量擬合的相對標準不確定度占比54%。保健食品的基質復雜[11]，適當凈化可提高檢測結果的精密度，同時還能規避樣品基質對儀器的污染。水—氯化鈉鹽析法常用于去除果蔬農藥殘留中水分等物質[12]，因此在他汀類物質檢測方法的前處理過程引入水—氯化鈉鹽析步驟可以有效地溶解保健食品中色素、糖類等干擾物質。研究擬采用水—氯化鈉鹽析法對保健食品提取物進行凈化，然后利用GC-MS檢測美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀含量，根據CNAS-GL 06—2019《化學分析中不確定度的評估指南》和JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》的要求并結合文獻[13-16]，建立相關數學模型，分析及評定各不確定度分量的來源，最后利用不確定度評定對水—氯化鈉前處理保健食品的檢測方法進行評價分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他?。?00 mg/L，中國First Standard公司；

乙腈、丙酮：色譜純，美國Honeywell公司；

氣相色譜質譜聯用儀：GCMS-QP 2010 Ultra型，日本島津公司；

電子天平：CPA225D型，賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 樣品前處理方法

稱取樣品2.00 g，加入乙腈10.0 mL，超聲15 min后過濾至含有5 mL水和2 g氯化鈉的離心管中，漩渦振蕩后靜置5 min，分取5.00 mL乙腈上層液，80 ℃氮吹至干，1.00 mL丙酮復溶，過0.22 μm尼龍濾膜，備上機。外標法定量。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 混合標準工作液 分別準確量取美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀儲備液(100 mg/L)各0.50 mL，合并后使用丙酮定容至10.0 mL容量瓶；混合標準工作液質量濃度為5 mg/L。

1.3.2 混合標準工作系列 從5 mg/L混合標準工作液中分取10，50，100，500，1 000 μL；以丙酮分別定容至5.0 mL容量瓶；此時標準系列質量濃度為0.01，0.05，0.10，0.50，1.00 mg/L。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件 進樣口溫度270 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL；Rxi-5ms色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，柱溫：初溫100 ℃，保持2 min，然后以15 ℃/min升至295 ℃，保持2 min；載氣：氦氣(純度≥99.99%)；恒壓模式：120 kPa。

1.4.2 質譜條件 電離模式為電子轟擊源(EI)，能量為70 eV，離子源溫度220 ℃，接口溫度290 ℃；掃描方式：離子掃描(SIM)。主要色譜及質譜參數詳見表1。

1.5 標準不確定度分量的評定公式

按式(1)計算合成相對標準不確定度。

(1)

表1 保留時間及定量離子信息

式中：

uc——合成相對標準不確定度；

按式(2)計算相對標準不確定度。

(2)

式中：

urel——相對標準不確定度；

x——樣品質量濃度測定值。

按式(3)計算擴展不確定度。

U=kuc(x)，

(3)

式中：

U——擴展不確定度；

k——常數(95%置信水平)，取2。

2 結果與分析

2.1 數學模型的建立

(4)

式中：

ω——樣品中目標物的含量，mg/kg；

C——樣品中目標物的質量濃度，mg/L；

V——定容體積，mL；

D——稀釋因子；

m——稱樣量，g；

frep——重復性引入的修正因子。

2.2 不確定度的來源分析

基于測定方法及數學模型，影響試驗不確定度的主要分量為標準溶液配制、標準曲線擬合、定容體積、稱樣量以及重復性等。影響各分量的因素詳見圖1。

圖1 不確定度來源分析圖

2.3 各不確定度分量的評定

2.3.1 標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度

(1) 標準儲備液引入的相對標準不確定度：依據各項目的標準物質證書所提供的擴展不確定度U、包含因子k、標準物質濃度值X等信息，以B類評定方法計算標準儲備液所引入的相對標準不確定度urel(C1)，見表2。

表2 標準儲備液的不確定度

(2) 配制過程引入的相對標準不確定度：依據1.3步驟，標準工作液的配制過程涉及10.0 mL容量瓶、500 μL移液器。試驗使用的A級容量瓶所引入的不確定度由容量校準不確定度u(C容A)、溫度效應不確定度u(C容B)兩個分量組成；移液器引入的不確定度由容量校準不確定度u(C移A)、溫度效應不確定度u(C移B)兩個分量組成。

移液器引入的不確定度擬合方法與容量瓶一致。標準工作液使用的500 μL移液器引入的相對標準不確定度結果見表3，為2.58×10-3。

表3 定量器具引入的不確定度

1.3.2步驟中逐級稀釋引入的不確定度可忽略不計。因此，按式(5)計算配制過程引入的相對標準不確定度urel(C2)：

(5)

計算結果為4.18×10-3。

(3) 樣品中目標物濃度引入的相對標準不確定度：按式(6)計算目標物濃度的相對標準不確定度urel(C)：

(6)

計算可得美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀在標準溶液配制引入的urel(C)分別為4.22×10-3，4.22×10-3，4.21×10-3。

2.3.2 標準曲線擬合所引入的相對標準不確定度 取1.3.2 配制的5個標準工作溶液分別測定3次，以峰面積A為縱坐標，標準溶液濃度Ci為橫坐標擬合線性方程，結果見表4。取樣品加標后上機測定，根據標準曲線回歸方程計算樣品中美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀他的濃度，按式(7)分別計算3種他汀類物質的標準溶液濃度差的平方和：

表4 標準曲線數據?

(7)

式中：

Sxx——標準溶液濃度差的平方和；

Ci——不同標準溶液質量濃度值，mg/L；

按式(8)分別計算3種他汀類物質的標準溶液峰面積殘差的標準差：

(8)

式中：

S——標準溶液峰面積殘差的標準差；

Aj——標準溶液的峰面積；

B0——標準曲線的截距；

B1——標準曲線的斜率；

n——標準曲線中校準點的測量次數，n=15。

將式(7)、式(8)計算所得結果帶入式(9)中計算3種他汀類物質標準曲線擬合所引入的不確定度：

(9)

式中：

u(curve)——標準曲線擬合引入的不確定度；

p——實際被測樣品的重復測量次數，p=2；

x——實際被測樣品的平均質量濃度值，mg/L。

計算所得美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀的相對標準不確定度為1.48×10-2，1.54×10-2，2.77×10-2。

2.3.3 定容體積引入的相對標準不確定度 從10.0 mL樣品的乙腈提取液中分取5.0 mL進行凈化或濃縮處理，稀釋因子D為2；樣品提取液經80 ℃氮吹至干后，準確加入1.00 mL丙酮復溶。以上過程使用的是10,5 mL的單標線吸量管及1 000 μL移液器，其引入的不確定度擬合計算方法與2.3.1(2)容量瓶一致，計算結果詳見表3。三者引入的相對標準不確定度分別為2.51×10-3，2.68×10-3，2.58×10-3。按式(5)計算定容體積引入的相對標準不確定度為4.49×10-3。

2.3.4 稱樣量引入的相對標準不確定度 稱樣量為2.00 g，依據JJG 1036—2008標準及該天平校準證書可知，其偏載誤差為5.0×10-5g，k=2，則按式(10)計算稱樣量引入的相對標準不確定度：

(10)

式中：

d——偏載誤差，g；

k——常數(95%置信水平)，取2；

m——稱樣量，g。

計算結果為1.25×10-5。

2.3.5 重復性引入的相對標準不確定度 重復稱量同一陰性樣品11份，分別進行0.10 mg/kg加標，相同條件下進行前處理并測定含量值。采用A類評定，按式(11)計算重復性引入的相對標準不確定度：

(11)

式中：

urel(ωi)——重復性引入的相對標準不確定度；

S(ωi)——11份加標樣品含量值的標準偏差，mg/kg；

e——加標樣品的平行份數，e=11；

為考察水—氯化鈉凈化步驟對測定結果重復性的影響。重復稱量同一陰性樣品11份，分別進行0.10 mg/kg洛伐他汀加標試驗。操作步驟不包括水—氯化鈉鹽析，其余步驟與1.2一致。11組樣品的測定結果分別為0.131 1，0.109 4，0.110 3，0.120 3，0.102 2，0.104 1，0.119 0，0.120 4，0.103 2，0.130 9，0.117 2 mg/kg。此時，重復性引入的相對標準不確定度按式(11)計算，結果為2.59×10-2。其他項目重復性的測定結果見表5。

表5 各項目的重復性的測定結果

2.4 合成不確定度

匯總試驗所用檢測方法涉及到的相對標準不確定度分量，在此基礎上，擬合95%置信區間，包含因子k=2的合成相對標準不確定度ucrel(ω)、合成不確定度uc(ω)、擴展不確定度U(ω)以及檢測結果ω見表6。

由表6可知，試驗所用檢測方法對美伐他汀、洛伐他汀及辛伐他汀擬合的各不確定分量大小的趨勢一致，主要來源是標準曲線擬合，其次是定容體積、標準溶液配制以及重復性。通過對比樣品經過水—氯化鈉凈化與否，得出洛伐他汀引入的重復性相對標準不確定度結果：經凈化后的值為3.12×10-3，未經凈化后的值為2.59×10-2，前者約為后者的10%，與孫麗萍等[10]有關HPLC法測定保健食品中洛伐他汀含量的不確定度擬合分量結果一致，最后檢測結果表述為(0.99±0.06) mg/g (k=2)，擴展不確定度與檢測值之比為6.06%。在孫麗萍[10]的研究中，不確定度的主要來源是重復性，相對標準不確定度為0.023 3，占各不確定度分量和的54%，遠超過試驗方法擬合的重復性分量0.003 12以及對應的占比5%。綜上，若保健食品樣品未經凈化，樣品基質干擾導致重復性引入大量的不確定度，對結果的準確性影響較大。試驗所建立的前處理方法引入水—氯化鈉凈化步驟，有利于提高檢測結果的精密度。

表6 各分量的相對標準不確定度匯總表

3 結論

對保健食品中他汀類藥物進行GC-MS檢測時，采用水—氯化鈉凈化法前處理，能夠降低樣品基質的干擾，減少重復性引入的不確定度，提高檢測結果的精密度和準確度。重復性及樣品的稱取都會引入不確定度，但其主要來源于標準曲線擬合、定容體積以及標準溶液配制。因此，平時檢驗檢測過程中要注意前處理的規范性，盡可能選用高精度以及經校準為A級量具配制溶液等。同時應定期對GC-MS進行期間核查以及檢定校準，使用過程中關注儀器的狀態并做好維護，以保證測定結果的可靠性。