超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇殘留量的方法優(yōu)化

鐘名琴，陳 彤，丁燕玲，黃 婷，何玉榆，譚 磊*

(1.深圳市質(zhì)量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518000；2.廣東省市場監(jiān)督管理局食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)管重點實驗室，廣東 深圳 518000)

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，牛奶的銷量也不斷增加，能為人類提供蛋白質(zhì)、維生素和鈣等營養(yǎng)物質(zhì)。玉米赤霉醇是人工合成的非類固醇同化性激素，曾被官方批準用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[1]，用來提高畜禽的飼料轉(zhuǎn)化率[2]，促進它們的生長[3]。然而，農(nóng)產(chǎn)品在生長期間，飼料和農(nóng)產(chǎn)品在加工、貯藏、運輸過程中，均易造成玉米赤霉醇類藥物污染。當給奶牛飼喂受到污染的飼料時，飼料中的玉米赤霉醇等可通過血-乳屏障進入到牛奶中，導(dǎo)致食用牛奶含有玉米赤霉醇類藥物，并通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，影響和破壞人畜的生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)等。這不僅會給畜牧業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，也會對食品安全構(gòu)成嚴重威脅，因此已成為各地政府關(guān)注的問題。20 世紀80 年代左右，毒理學(xué)研究表明，這類藥物會引發(fā)癌癥。為了防止這些激素隨畜產(chǎn)品進入人體，各國陸續(xù)頒布法令，禁止在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中使用。中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250 號公告明確規(guī)定，在食品生產(chǎn)動物的飼養(yǎng)中禁止使用玉米赤霉醇，所產(chǎn)出的所有可食用動物產(chǎn)品不得檢出[4]。

為有效監(jiān)督牛奶質(zhì)量安全，建立一種快速、可靠、準確、靈敏的玉米赤霉醇殘留量的分析方法具有重要意義。目前，玉米赤霉醇類藥物的測定方法有薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)[5]、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunoassay，ELISA)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)[7]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromagraphy-mass spectrometry，LC-MS/MS) 等[9-11]，雖然相關(guān)文獻已報道可用LCMS/MS 測定牛奶中的玉米赤霉醇，但是大多數(shù)檢測方法存在操作復(fù)雜、提取效果差、回收率低的缺點。

本方法優(yōu)化并建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法來檢測牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的殘留量。該方法簡便可靠、靈敏度好、準確度高，無需經(jīng)過凈化可直接上機測定，有效解決了傳統(tǒng)標準方法，例如，GB/T 23218-2008 中前處理過程繁瑣[12]，易揮發(fā)性無水乙醚作為提取試劑具有提取分離效果差、對操作人員身體健康造成較大危害的缺陷，從而為食品安全和人們身體健康提供保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

Aglient 1290 超高效液相色譜儀、配有電噴霧(ESI) 離子源的AB Sciex Triple QuadTM5500 質(zhì)譜儀(美國AB Sciex 公司)、N-EVAP-24 型全自動氮吹儀、IKA 旋渦混合器、梅特勒PL602E 型天平、Sigma 3-30KS 離心機、Milli-Q Integral 3 型超純水儀、奧特賽斯AS 系列超聲波清洗機、CEM PHOENIX 微波馬弗爐。

1.1.2 藥品與試劑

乙腈(色譜純)、無水硫酸鈉(分析純，使用前需540 ℃烘干8 h)等。

α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇：純度高于90.0%，均為德國Dr.Ehrenstorfer 公司產(chǎn)品。

1.2 樣本制備

取代表性樣本約500 g，混勻，裝入潔凈容器，密封，標記。在抽樣及制備的操作過程中，應(yīng)防止樣本收到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。并將試樣于0 ℃～4 ℃保存。

1.3 標準儲備液和混合標準工作液的配制

準確稱取α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的標準品，分別用乙腈溶解并稀釋成濃度為1.00 mg/mL 的標準儲備液，－ 18 ℃以下冷凍避光保存6 個月。再分別移取適量上述各物質(zhì)標準儲備液，用乙腈逐級稀釋成適當濃度的混合標準工作液。

1.4 樣本前處理

準確稱取牛奶樣本2.0 g±0.02 g 于 50 mL 離心管中，加入10 mL 乙腈后立即渦旋搖勻，再加入4 g 無水硫酸鈉，渦旋混勻4 min，超聲提取10 min，4 ℃ 9 000 r/min離心8 min，吸取上清液，氮吹近干，用1.00 mL乙腈復(fù)溶，過0.22 μm 有機相濾膜后，可直接上機測定。

1.5 UPLC-MS/MS 條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITYUPLC BEH C18(1.7 μm，3.0 mm×100 mm)；流動相A 為純水；流動相B 為乙腈(色譜純)；柱溫40.0 ℃；進樣體積5.00 μL。具體梯度洗脫程序見表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiplereaction monitoring，MRM)；電噴霧電壓：－4.5 kV；離子源溫度：500 ℃；氣簾氣壓力：35.0 psi；碰撞氣壓力：9 psi；霧化器壓力：55.0 psi；輔助加熱器壓力：55.0 psi。

保留時間、定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量見表2。

空白基質(zhì)分別添加10.0 μg/kg α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線

準確稱取5 個牛奶空白基質(zhì)樣本，按“1.4 樣本前處理”的方法處理，獲得空白樣本提取液。將空白樣本基質(zhì)配制成不同濃度系列的混合標準工作溶液(質(zhì)量濃度依次為：1.00 ng/mL、2.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL)。按方法條件設(shè)置儀器參數(shù)，待儀器穩(wěn)定后供超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，并繪制標準工作曲線。可發(fā)現(xiàn)基質(zhì)試驗峰面積與相應(yīng)回收濃度的線性關(guān)系好，其中α-玉米赤霉醇的相關(guān)系數(shù)為r＝0.999 5，β-玉米赤霉醇的相關(guān)系數(shù)為r＝0.999 5，具體見表3。

2.2 方法檢出限確定

以空白牛奶樣本為基質(zhì)，做七個平行添加試驗，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的陽性添加濃度均為1.00 μg/kg，按照1.4進行前處理，進行上機測定。根據(jù)各樣本檢測值計算出平均值X 及標準偏差Sb，按公式檢出限(MDL)=(k×Sb×C)/X(k為置信因子，一般取3；C 為理論加標水平，單位為μg/kg)計算，測得α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的方法檢出限分別為9.22×10-2μg/kg、6.28×10-2μg/kg，見表3。

2.3 方法回收率和精密度驗證

用空白牛奶基質(zhì)樣本分別對α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇進行3 個不同濃度水平的添加回收實驗，每個水平均取6 個平行樣，陽性添加濃度分別為1.00 μg/kg、2.00μg/kg、10.0 μg/kg。按“1.4 樣本前處理”的方法進行處理，處理好的樣本供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。牛奶樣本中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇的平均回收率和相對標準偏差結(jié)果詳見表4。

由表4 可知，該方法的回收率較好，牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的回收率分別為81.5 %～105.0 %、86.7%～97.0%，相對標準偏差均小于7.0%，說明該方法重復(fù)性好、定性、定量準確，并且峰形受基質(zhì)的干擾比較小。

3 結(jié)論

本方法旨在建立一種牛奶中α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜簡便測定方法，為相關(guān)監(jiān)管部門監(jiān)管快速、準確測定牛奶中該類藥物提供方法參考和技術(shù)支持。試驗結(jié)果表明，該方法可以在很大限度上減少樣本前處理時間，方法靈敏度及準確度高，提取分離度好。與傳統(tǒng)的方法相比，該方法采用乙腈直接提取的方式極大限度提高了檢測效率，可適用于牛奶中α-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇殘留量的定性、定量檢測。