全懸浮STHN-XF 細胞的純凈性及核型分析

林鷙，趙本進，何錫忠，朱永軍，彭麗英*

(1 上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2 上海佳牧生物制品有限公司，上海 201403)

懸浮培養細胞在國際上發展較快，已趨向成熟，是生物制品生產中應用較普遍的一種生產工藝模式。與轉瓶培養細胞相比，該工藝具有操作簡單、省時、成本低等優點。根據前期對豬偽狂犬病病毒株的細胞適應性的研究結果，用豬源傳代細胞系——豬睪丸細胞(swine testis cell，ST 細胞)繁殖豬偽狂犬病病毒株來制備疫苗效果最佳。本文對ST 細胞進行懸浮培養馴化、傳代，并對全懸浮STHN-XF 細胞的F1、F5、F26、F36 代進行純凈性和核型分析。

1 試驗材料

1.1 全懸浮STHN-XF 細胞

全懸浮STHN-XF 細胞為上海市農業科學院畜牧獸醫研究所課題組自行馴化和傳代的懸浮細胞株。

1.2 培養基

培養細胞用的VirusPro ST-S 細胞無血清培養基購自上海源培生物科技股份有限公司。無菌檢驗用的硫乙醇鹽流體培養基、胰酪大豆胨液體培養基均購自中海生物技術有限公司。支原體檢驗用的液體培養基和固體培養基均購自中海生物技術有限公司。

1.3 熒光抗體檢測試劑盒

牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環病毒2 型及豬瘟病毒的間接熒光檢測試劑盒購自中海生物技術有限公司。

1.4 細胞核型分析試劑

秋水仙堿、0.075 M 氯化鉀溶液、Carnoy固定液[V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3 ∶1]，現用現配。

1.5 其他

其他化學試劑、液氮罐、低溫冰箱、37 ℃的CO2培養箱、25 ℃的CO2培養箱、搖床、生物反應器及其他儀器設備由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所提供。

2 試驗方法

2.1 細胞傳代

將懸浮馴化好的STHN-XF 細胞37 ℃懸浮培養48 h，細胞密度達到3×106個/mL 以上進行傳代，連續傳代至F36 代，其中將F7～F16 代細胞作為生產細胞進行凍存。細胞凍存液成分為：新生牛血清20%、二甲基亞砜(DMSO)10%、最低必需(MEM) 培養基70%。凍存程序為4 ℃ 30 min，－ 20 ℃ 1 h，－70 ℃ 8 h(或過夜)，將F0 和F1 代作為原始細胞于液氮中保存。

2.2 樣本準備

分別隨機取F1、F5、F16、F26、F36 代細胞各3 瓶，將同一代細胞充分混合、培養后，將其作為待檢樣本分別進行無菌、支原體及外源病毒檢驗。

2.3 純凈性檢驗

無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗均按現行2015《中華人民共和國獸藥典》進行[1]。

2.3.1 無菌檢驗

分別將0.2 mL F1、F5、F16、F26、F36代細胞的待檢樣本移植到2 支硫乙醇鹽流體培養基管中，1 支置37 ℃培養，1 支置25 ℃培養；另分別取0.2 mL 各代細胞移植到1 支胰酪大豆胨液體培養基管，置25 ℃培養。培養7 d 后，觀察硫乙醇鹽流體培養基和胰酪大豆胨液體培養基的顏色是否變黃或變渾濁。

2.3.2 支原體檢驗

分別將5 mL F1、F5、F16、F26、F36 代細胞的待檢樣本移植到裝有20 mL 液體培養基的小瓶中，搖勻后從中取0.4 mL 移植到含1.8 mL 培養基的2 支小管中，每支0.2 mL，將小管和小瓶置37 ℃培養，分別于移植后 5 d、10 d、15 d 從小瓶中取0.2 mL 培養物到小管中，每日觀察培養物顏色有無變黃或變紅。如果無變化，在最后一次移植到小管中培養14 d 后停止觀察。如果發現小瓶或任何一支小管培養物顏色出現明顯變化，應立即將小瓶中的培養物移植到小管液體培養基和固體培養基中，觀察液體培養基是否出現恒定的pH 變化，及固體培養基上有無典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

2.3.3 外源病毒檢驗

分別將1 mL F1、F5、F26、F36 代細胞的待檢樣本移植到3 瓶單層Vero 細胞和ST 細胞(總面積不少于100 cm2)，培養7 d，連傳2 代，用吉姆薩染色液對單層細胞進行常規染色，觀察是否出現包涵體、巨細胞或其他外源病毒所致的細胞病變。

接種各代次細胞時加入適量0.2%豚鼠紅細胞和雞紅細胞的等體積混合液，分別在 2 ℃～8 ℃和20 ℃～25 ℃條件下觀察紅細胞吸附現象。

按照間接熒光檢測試劑盒說明書，檢驗各代次細胞是否感染牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環病毒2 型及豬瘟病毒。

2.4 細胞核型分析

2.4.1 收獲細胞

取分裂旺盛期的F1、F5、F26、F36 代的STHN-XF 細胞，用新鮮的培養液調整細胞濃度為2×106個/mL～4×106個/mL，加入秋水仙堿，使其質量濃度為0.05 μg/mL，置 37 ℃培養箱中處理2 h～3 h，即可收獲細胞。

2.4.2 低滲處理

取出用秋水仙堿處理后的細胞，用吸管輕輕吹打混勻，移入10 mL 離心管中，1 200 r/min 離心10 min，去掉上清液，加入10 mL 0.075 M 氯化鉀溶液，用吸管輕輕吹打混勻，置37 ℃培養箱中低滲處理30 min。

2.4.3 預固定

取出離心管，加入Carnoy 固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，1 200 r/min 離心10 min。

2.4.4 固定

取出離心管，去掉上清液。沿管壁緩慢加入Carnoy 固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，室溫固定30 min，1 200 r/min 離心 10 min。連續固定3 次。

2.4.5 制片

取出離心管，去掉上清液。用少量新鮮的固定液制成細胞懸液，常規法制片；70 ℃烤片2 h～3 h；標本片用0.25%吉姆薩染色液染色10 min。

2.4.6 核型分析

F1、F5、F26、F36 代 的STHN-XF 細 胞在顯微鏡下計數分析30～50 個中期分裂相。

3 結果

3.1 細胞庫的建立

將STHN-XF 細胞連續傳代至F36 代，其中F0～F16 代細胞每代凍存50 管于液氮中，F26 和F36 代各凍存10 管于液氮中。每管上標記細胞名稱、凍存代次及時間。

3.2 無菌檢驗結果

結果發現，F1、F5、F16、F26、F36 代細胞不管是在37 ℃，還是在25 ℃下培養7 d，硫乙醇鹽流體培養基的顏色均未變黃和變渾濁；在25 ℃下培養7 d，胰酪大豆胨液體培養基的顏色也未變黃或變渾濁。結果表明，各代次細胞均無細菌感染。結果見表1。

3.3 支原體檢驗結果

結果發現，陰性對照液體培養基的顏色沒有變化，移植到固體培養基后沒有出現典型的“煎蛋”狀菌落；陽性對照液體培養基的顏色變黃，在每次移植到固體培養基后的第7 天出現典型的“煎蛋”狀菌落；F1、F5、F16、F26、F36 代細胞移植到液體培養基后顏色均沒有變化，移植到固體培養基后均未出現典型的“煎蛋”狀菌落。結果表明，各代次細胞均無支原體感染。結果見表2。

3.4 外源病毒的檢驗結果

3.4.1 致細胞病變檢驗結果

結果發現，陰性對照未出現包涵體、巨細胞或其他外源病毒所致的細胞病變，陽性對照出現了典型的細胞病變，F1、F5、F16、F26、F36 代細胞均未出現細胞病變。結果表明各代次細胞均未感染外源病毒。

3.4.2 紅細胞吸附檢驗結果

結果發現，不管在2 ℃～8 ℃，還是 20 ℃～25 ℃條件下，各代次細胞均未發現有紅細胞吸附現象，結果見表3。

3.4.3 熒光抗體檢測結果

對F1、F5、F26、F36 代細胞進行牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒和豬圓環病毒2 型的免疫熒光抗體檢測后，結果未發現熒光，表明各代次細胞均未感染上述3 種病毒。結果見表4。

3.5 核型分析

對F1、F5、F26、F36 代細胞的染色體進行計數發現，各代細胞的染色體數目均為38條。詳見圖1。

4 結論

F1、F5、F16、F26、F36 代的懸浮STHNXF 細胞經無菌檢驗、支原體檢驗、外源病毒檢驗發現，各代次的STHN-XF 細胞均無菌，無支原體，無外源病毒，表明各代次STHN-XF 細胞都是純凈的。

通過對STHN-XF 細胞的F1、F5、F26、F36代核型分析，結果表明細胞染色體數目均為19 對，即38 條，且核型相同。

懸浮培養指的是非貼壁依賴性細胞的培養，細胞懸浮于培養基中生長或維持。懸浮培養可以降低生產成本，提高生產效率，便于擴大生產規模[2]。國內生物制品行業應快速實現行業升級，早日實現新技術的引進、消化和吸收，并進一步創新，早日與國際接軌，提高我國生物制品行業在國際上的競爭力[3]。