骨康膠囊組分酢漿草和芭蕉根對家兔骨折愈合的作用及機制*

唐銀彤，楊健，李靖，王永林，李勇軍，楊暢，孫佳，劉春花，劉亭**

(1.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004；3.貴州省食品藥品檢驗所 保健食品化妝品檢測室，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

骨折(fracture)指骨或軟骨連續性或完整性發生完全性或不完全性的中斷，多發于老年人群體，是常見的臨床疾病之一[1-2]。骨折愈合是極為漫長的修復過程，對患者的治療成本和生活質量都有著重大影響[3-4]。研究表明，骨康膠囊可加速骨折愈合速度，促進骨形成、抑制骨吸收、調節骨代謝、提高骨密度及促進骨折的愈合，但是其機制尚不清楚[5-8]。骨康膠囊由酢漿草、芭蕉根、補骨脂、續斷及三七等組成，其中酢漿草、芭蕉根為君藥，補骨脂、續斷為臣藥，三七為佐藥[9-10]。酢漿草具清熱利濕、涼血散瘀等功效，有研究表明酢漿草水提物在體外可以促進成骨細胞的增殖、分化和礦化，在臨床上對扭傷及骨折愈合有顯著療效[11]；芭蕉根具清熱解毒、抗炎止痛等功效，常用于治療骨質疏松、骨折等疾病，在臨床上發揮了較好的治療作用[12]。目前，酢漿草和芭蕉根已有相關的臨床研究及體外研究[13-14]，但尚未見酢漿草及芭蕉根對骨折愈合的體內作用機制的相關報道。因此，為進一步了解骨康膠囊療效并闡明其作用機理，本研究利用家兔橈骨骨折模型，探討骨康膠囊組分酢漿草、芭蕉根對家兔血液流變性、血清鈣(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量，并結合骨折部位的病理學檢查闡明其治療作用，為骨康膠囊進一步開發應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 4月齡雄性健康家兔35只，體質量2.0～2.5 kg，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供[合格證號SCXK (渝) 2012-0003]；家兔飼養于濕度40%～70%、溫度20～25 ℃的環境中，實驗前動物適應環境7 d。

1.1.2主要藥品與試劑 接骨七厘片(規格0.3 g生藥量/片，湖南金沙藥業)，酢漿草及芭蕉根藥材(貴州維康子帆藥業)；ALP、P及Ca試劑盒(南京建成生物)。

1.1.3主要儀器 施力特P500-12型電鉆(寧波易睞軻)，超純水機(四川沃特爾)，EL204電子天平(上海梅特勒-托利多)，自動血液流變儀LBY-N6K(北京普利生)，DH6000BII型電熱恒溫培養箱(天津泰斯特)，Varioskan LUX多功能酶標儀、Thermo fresco 17低溫高速離心機(美國 Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模、分組及取樣 35只家兔隨機分為正常組、模型組、接骨七厘片組、酢漿草組及芭蕉根組，每組7只。正常組家兔給予蒸餾水灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續30 d。后4組家兔參照文獻方法[27]造模，予3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，固定于手術臺，常規左前肢剪毛、消毒、切開皮膚，分離周圍肌肉、軟組織及血管，暴露橈骨、小型電鋸制作骨折模型，造成左上肢橈骨中段3 mm的完全缺損，尺骨保持完整，切口滴青霉素4萬單位，止血、逐層縫合皮膚后包扎、不用石膏夾板固定，術后3 d青霉素40萬單位肌肉注射、1次/d。造模后第4天開始灌胃給藥，正常組、模型組家兔予蒸餾水灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續30 d；接骨七厘片組(0.140 g生藥/kg)、酢漿草組(0.224 g生藥/kg)及芭蕉根組(0.336 g生藥/kg)家兔予各處理藥物與蒸餾水調成的混懸液按體質量10 mL/kg灌胃，1次/d，連續30 d；各組家兔末次給藥24 h后，固定于手術臺，剪去心臟部位被毛，75%酒精消毒家兔皮膚，選擇心搏最明顯處穿刺，針頭刺入心臟取得所需血量，拔出針頭，采用耳緣靜脈注射空氣的方式處死家兔，剝離左側橈骨，10%甲醛溶液固定，待后續實驗備用。

1.2.2血清ALP、Ca及P含量的測定 取1.2.1項下各組家兔心臟血3 mL，于4 ℃冰箱靜置2 h，待血液凝固；3 000 r/ min離心10 min，取血清，置于-80 ℃冷凍備用；后續實驗按ALP、Ca及P試劑盒說明書進行測定，計算各組家兔血清ALP、Ca及P的含量。

1.2.3血液流變性參數的測定 取1.2.1項下各組家兔心臟血5 mL，采用自動血液流變儀檢測全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血漿黏度、紅細胞壓積及血沉等血流變性參數。

1.2.4骨折病理檢測 取1.2.1項下各組家兔左側橈骨，于骨折部位上下各1 cm處鋸斷，剔除骨骼肌、軟組織，置于10%甲醛溶液固定；取固定好的骨組織于混合酸脫鈣液(蒸餾水800 mL、鹽酸100 mL及甲酸100 mL)中脫鈣1周，以大頭針能輕易刺入骨組織即為脫鈣完成；常規石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)法染色后，標本置于光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血清ALP、Ca及P水平

結果顯示，模型組家兔血清ALP、P水平較正常組明顯下降(P<0.01)，接骨七厘片組家兔血清ALP、P水平較模型組明顯升高(P<0.01)；酢漿草組、芭蕉根組家兔血清ALP水平較模型組明顯升高，但Ca、P水平無變化(P>0.05)。見表1。

表1 各組家兔血清ALP、Ca及P的水平Tab.1 Levels of serum ALP,Ca,and P in rabbits of each

2.2 血液流變學參數

血液流變學檢查結果顯示，模型組家兔全血全血黏度、血沉較正常組明顯升高(P<0.01)，接骨七厘片組家兔全血黏度、血沉較模型組明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，酢漿草組和芭蕉根組家兔全血中切、高切黏度降低(P<0.05或P<0.01)，但血漿黏度、紅細胞壓積與血沉比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組家兔的血液流變學參數Tab.2 Rheology parameters of rabbits in each

2.3 骨折部位組織學特征

結果顯示，正常組家兔可見正常的骨組織結構；模型組家兔可見斷骨端骨小梁纖細、稀疏，仍為纖維性組織連接，可見極少數成骨細胞；接骨七厘片組、酢漿草組及芭蕉根組家兔可見較多大量纖維組織和成骨細胞，斷端和骨膜下有較多的類骨質出現。見圖1。

圖1 各組家兔骨折部位的組織學特征(HE，×400)Fig.1 Histological feature of fracture sites in rabbits of each group(HE，×400)

3 討論

骨折愈合是一個復雜的多級修復過程，涉及骨骼對細胞內和細胞外信號分子的感應和傳導，其機制十分復雜，受年齡、力學環境及局部血液供應等多種因素的影響[15-16]。骨折修復過程中，成骨細胞、軟骨細胞及成纖維細胞分別合成、分泌骨基質，隨后鈣鹽能夠將其沉積并形成骨組織。在骨折愈合中，血Ca一般和血P共同發揮作用，骨、血液中的Ca、P相互轉移，呈現一種動態平衡[17]。ALP是一種分布于細胞膜的鈣結合轉運蛋白，主要由肝臟、腎上腺、骨骼等合成[18]。ALP可促進細胞成熟、鈣化并滲入血液中，使血液中的ALP含量增加，促進前成骨細胞向成熟成骨細胞分化，從而加快骨折愈合[19-21]。本研究顯示，給藥30 d后，家兔血清ALP水平結果表明，酢漿草組、芭蕉根組的ALP含量較模型組上調，但Ca、P水平無變化(P>0.05)，提示酢漿草、芭蕉根可通過提高ALP含量，從而促進骨折愈合。

當機體發生骨折創傷后，血流速度減慢，血漿黏度增加，其可能與局部血管損傷形成血腫有關[22-23]；也可能是體內兒茶酚胺的分泌量增加，全身血管收縮，肢體血流量下降，血流緩慢，組織產生缺血、缺氧、乳酸蓄積及自由基大量產生，引起血液粘稠度增加，從而導致血液循環異常，抑制骨折愈合[24-25]。骨折后血液濃、黏、聚、凝性顯著增高,其程度可用血液流變學指標來反映,各指標之間并不是孤立的,而是有著密切的聯系，在生理上相互依存,病理上相互影響。紅細胞壓積是影響血液黏度的最主要因素，血漿黏度反映了血液的粘滯性和濃稠性,影響組織血流灌注甚至形成血栓；血沉是反映血液聚集性的指標；全血低切變率黏度值反映紅細胞的聚集程度；全血高切變率黏度值反映紅細胞的變形程度；中切黏度值為低切到高切黏度變化的過渡點[26]。骨折早中晚期均表現為血液粘稠度增加，以早期較為明顯，其變化不僅發生在骨折局部，而且全身表現出瘀血特征[27]。本研究血液流變性結果顯示，給藥30 d后，與模型組比較，酢漿草、芭蕉根降低家兔全血中切、高切黏度，從而加快血流速度，降低家兔血漿黏度，改善血液流變性，紅細胞壓積與血沉無變化,表明酢漿草、芭蕉根能促進骨折愈合。

在骨折愈合過程中，骨吸收和骨形成過程是破骨細胞吸收舊骨和成骨細胞形成新骨的過程，二者緊密聯系共同完成骨的重建[28]。通過骨代謝指標含量測定可有效地反映骨折愈合過程中的骨代謝情況[29]。本研究病理學特征結果顯示，與模型組比較，酢漿草組和芭蕉根組家兔骨折部位可見大量纖維組織、成骨細胞，斷端和骨膜下出現較多類骨質，提示酢漿草、芭蕉根可通過促進成骨細胞增殖而加速骨折愈合過程。

綜上所述，酢漿草、芭蕉根可通過上調家兔ALP，降低其全血中切、高切黏度，改善血液流變性，從而促進家兔骨折愈合，提示酢漿草、芭蕉根在骨康膠囊治療骨折過程中具有重要作用。