糖通飲含藥血清對高糖培養HBZY-1細胞microRNA-21、Smad7以及α-SMA表達的影響*

伏紅穎，潘艷伶，陳俞如，陳洪民

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院 中醫學教研室，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫科大學附屬醫院 中醫科，貴州 貴陽 550000)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的慢性并發癥之一，已經成為引起終末期腎病的主要原因之一，嚴重威脅人類健康。腎小球系膜細胞是腎小球的固有細胞，具有收縮、吞噬、增殖、分泌細胞外基質(extracellular matrix，ECM)、產生細胞因子以及生長因子的作用，系膜細胞的增殖以及ECM的積聚是導致DKD腎纖維化的重要因素[1]。近年來研究發現，α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)與腎小球系膜細胞的增殖和ECM積聚密切相關[2]；高糖狀態下過表達的microRNA-21(miR-21)可促進ECM增多，加快腎纖維化進程[3]；而作為miR-21靶基因的Smad7[4]，其表達被抑制，也會促進腎纖維化的進程[5]。本課題組在前期動物及臨床實驗研究中發現，臨床經驗方糖通飲可降低早期DKD大鼠24 h尿蛋白水平，保護DKD大鼠腎組織，延緩DKD進展，且在臨床使用中療效顯著[6-7]。推測糖通飲可能通過抑制miR-21和α-SMA的表達、升高Smad7表達達到抑制高糖狀態下系膜細胞增殖的作用，本實驗觀察高糖環境下糖通飲中藥血清對HBZY-1細胞增殖以及對miR-21、Smad7、α-平滑肌蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)因子的影響，從細胞層面進一步探尋糖通飲延緩DKD進展的可能靶點，為糖通飲的臨床使用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 30只SPF級雄性SD大鼠，體質量(180±20) g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號SCXK(遼)2020-0001,動物實驗設計嚴格經過貴州醫科大學臨床醫學院倫理委員會審查(審批編號2000575)，實驗動物使用許可證號SYXK(黔)2018-0001。大鼠腎小球系膜細胞株HBZY-1(批號HTX1809)，購自深圳Otwo Biotech公司。

1.1.2藥物 糖通飲顆粒制劑，由廣東一方制藥有限公司提供，組成藥物為生地3.6 g(相當于12 g生藥飲片)、山藥0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、山茱萸2.5 g(相當于10 g生藥飲片)、茯苓0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、澤瀉0.9 g(相當于9 g生藥飲片)、丹皮2 g(相當于12 g生藥飲片)、黃芪4 g(相當于20 g生藥飲片)、丹參2.7 g(相當于15 g生藥飲片)、地骨皮0.75 g(相當于15 g生藥飲片)、草決明3 g(相當于15 g生藥飲片)。一付生藥138 g等于糖通飲顆粒劑20.95 g；將糖通飲顆粒劑20.95 g溶入飲用水138 mL中，生藥濃度為1 g/mL。

1.1.3主要試劑 抗Smad7抗體(批號ab216428)和抗α-SMA抗體(批號ab7817)購自abcam公司，抗GAPDH 抗體(批號HRP-60004)、山羊抗兔IgG-HRP二抗(批號M21002S)購自proteintech公司，胰酶細胞消化液(批號25200-056)、DMEM培養基(批號C11885500BT，5.5 mmol/L glucose)由Gibco Introvagen公司提供，青鏈霉素雙抗(批號SV30010)由HyClone公司提供，Opti-MEM(批號31985-070)購自Gibco公司，Lipofectamine 2000(批號11668027)購自Invitrogen公司，特級胎牛血清(南美，批號04-001-1ACS)由BI公司提供，cDNA合成試劑盒(批號K1622)購自thermo公司,PCR逆轉錄試劑盒(批號HB190916)、SYBR(批號HB210322)購自上海翊圣生物科技有限公司，miR-21的q-pcr試劑盒(批號C10712-1)購自銳博公司，CCK-8試劑盒(批號K1018)購自APExBIO公司。

1.1.4主要儀器 CO2培養箱(美國thermo公司)、超凈工作臺(蘇州凈化)、倒置顯微鏡(德國 Leica 公司)、實時熒光定量PCR儀C1000(美國 BIO-RAD 公司)、凝膠成像分析系統(上海天能科技公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 細胞鑒定后，選取第3～15代細胞在體積分數為10% FBS的DMEM培養基中(包含FBS、青鏈霉素和5.5 mmol/L葡萄糖DMEM)培養，待細胞融合度達80%～90%時進行傳代，細胞置于37 ℃、體積分數為5%CO2的細胞培養箱中。

1.2.2含藥血清的制備 30只SPF級雄性SD大鼠，隨機分為空白對照組和糖通飲組，每組15只；糖通飲生藥濃度為1 g/mL，按照人體-大鼠體表面積比值換算，以12.4 g/(kg·d)灌胃給藥,空白對照組給予等體積的雙蒸水，兩組均連續灌胃7 d；末次灌胃1 h后，分別經股動脈取血，血樣靜置2 h后，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，分離血清后分裝放入1.5 mL EP管，做好標記，并置于60 ℃水浴30 min，滅活補體，在超凈工作臺過濾除菌后，凍存于-80 ℃[8]。

1.2.3不同濃度含藥血清DMEM培養基配置 以高糖+低濃度糖通飲含藥血清培養基(30 mmol/L葡萄糖+體積分數5%糖通飲含藥血清)50 mL的配比為例：稱取 0.220 7g 的葡萄糖充分溶于 47.5 mL 的正常糖培養液中，在超凈工作臺用過濾器過濾后，加入2.5 mL糖通飲含藥血清，顛倒混勻后分裝于5 mL離心管中，充分混勻后于-20 ℃或者4 ℃儲存。中、高濃度糖通飲含藥血清培養基配比方法同高糖+低濃度糖通飲含藥血清培養基配比，糖通飲含藥血清和DMEM所取體積按對應比例。

1.2.4CCK-8法篩選最佳濃度中藥血清 系膜細胞計數后，將細胞以3×104/mL 接種于96 孔板中，細胞貼壁后，用無血清正常糖DMEM培養液同步化細胞24 h，同時設立正常糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖)、高糖+低、中、高濃度糖通飲含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖)共5個組，每組6個復孔(低、中、高濃度組的中藥血清濃度體積分數分別為5%、10%以及15%糖通飲大鼠血清[9])，按分組給予相應體積分數糖通飲含藥血清干預。培養48 h后，每孔加入0.5%的CCK-8溶液10 μL，繼續培養4 h，用酶標儀檢測各孔在波長450 nm處吸光值，同時設置空白組和對照組。計算細胞增殖率，細胞增殖率=[(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%，以確定最佳濃度糖通飲含藥血清，并將這一濃度用于后續實驗中。

1.2.5CCK-8法檢測實驗各組HBZY-1細胞增殖情況 檢測方法同1.2.4，篩選出最佳濃度糖通飲含藥血清后，將細胞共分為正常糖+空白血清組(5.5 mmol/L葡萄糖+10%空白血清組大鼠血清)、高糖+空白血清組(30 mmol/L葡萄糖+10%空白血清組大鼠血清)、高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組[30 mmol/L葡萄糖+10%糖通飲組大鼠血清(1.2.4實驗篩選出的最佳濃度血清)]，每組6個復孔。

1.2.6實時熒光定量PCR法檢測各組細胞miR-21表達，以及Smad7、α-SMA的mRNA表達 收集培養的各組細胞，按Trizol說明書提取細胞總RNA。根據廣州銳博的miRNA逆轉錄試劑盒和miRNA q-PCR試劑盒說明書檢測miR-21的表達，以U6作為內參(miR-21和U6的引物均由廣州銳博公司設計)。根據上海翊圣公司反轉錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒檢測Smad7、α-SMAmRNA表達，以GAPDH作為內參；引物序列Smad7為 F-5′-GAGGCTACTGTGTCCAAGA-3′、R-5′-TGTTGTCCGAATTGAGCTGTC-3′(95 bp)，α-SMA為F-5′-AGCGTGGCTATTCCTTCGT-3′、R-5′-CTCATTTTCAAAGTCCAGAGCTACA-3′(95 bp)，內參照GAPDH為F-5′-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3′、R-5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′(92 bp)。2-ΔΔCt計算各組基因相對表達量，并進行統計分析。

1.2.7Western blot法檢測各組細胞Smad7、α-SMA的蛋白表達 將培養結束的六孔板拿出，吸去培養基，用PBS洗3次，加入含PMSF的裂解液，于冰上裂解40 min后收集到標記好的EP管中，4 ℃，12 000 r/min離心30 min，將上清液吸入新的EP管，按4 ∶1(裂解液 ∶5×Buffer)的比例加入5×Buffer，震蕩混勻，煮沸后經過10%SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，50 g/L脫脂牛奶封閉，TBST洗膜后，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，Bio-Rad凝膠成像系統曝光后，以GAPDH 為內參，對PVDF膜的顯影條帶進行灰度分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HBZY-1細胞生長狀態

大鼠HBZY-1細胞傳代24 h后，即可貼壁，貼壁后經倒置顯微鏡觀察顯示，細胞呈星狀或梭形，生長狀態較好，可進行藥物干預。見圖1。

注：A為細胞貼壁24 h，B為細胞貼壁48 h。圖1 HBZY-1細胞生長狀態(5.5 mmol/L葡萄糖，×40)Fig.1 Growth status of HBZY-1 cells (5.5 mmol/L glucose,×40)

2.2 不同濃度中藥血清組細胞增殖情況

結果顯示，與正常糖組相比，高糖組細胞增殖率明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.05)；與高糖組相比較，低、中、高濃度糖通飲含藥血清組細胞增殖率均降低，差異有統計學意義(F=15.3，P<0.05)；中、高濃度糖通飲含藥血清組間細胞增殖率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。因此，后續實驗選擇中濃度糖通飲含藥血清作為處理因素。見表1。

表1 不同濃度中藥血清組細胞增殖情況(n=3)Tab.1 Cell proliferation in serum groups with different concentrations of traditional Chinese medicine(n=3)

2.3 HBZY-1細胞增殖情況

結果顯示，與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細胞明顯增殖，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比較，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組細胞增殖增殖率均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；提示糖通飲含藥血清可減輕HBZY-1細胞的增殖。見圖2。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖2 各組HBZY-1細胞的增殖情況(CCK-8，n=3)Fig.2 Cell proliferation in each experimental group(CCK-8，n=3)

2.4 HBZY-1細胞miR-21的表達以及Smad7、α-SMA mRNA表達

結果顯示，與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組HBZY-1細胞的miR-21表達和α-SMAmRNA表達升高，Smad7 mRNA表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組細胞相比，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組HBZY-1細胞的miR-21 表達和α-SMAmRNA表達降低 ，Smad7 mRNA表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖3 各組HBZY-1細胞miR-21表達以及Smad7、α-SMA mRNA表達(n=3)Fig.3 Comparison of expression of miR-21,Smad7,andα-SMA mRNA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

2.5 HBZY-1細胞Smad7、α-SMA蛋白的表達

與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組HBZY-1細胞的Smad7蛋白表達降低，α-SMA蛋白表達增加，差異具有統計學意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組HBZY-1細胞相比，高糖+最佳濃度糖通飲含藥血清組HBZY-1細胞的Smad7蛋白表達增加，α-SMA蛋白表達降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Smad7、α-SMA、GAPDH蛋白Western blot 灰度值，B為Smad7/GAPDH、α-SMA/GAPDH蛋白直條圖；(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖4 各組HBZY-1細胞Smad7和α-SMA蛋白的表達(n=3)Fig.4 Protein expression of Smad7 and α-SMA in HBZY-1 cells of each group(n=3)

3 討論

腎纖維化是DKD的主要病理改變之一，它的形成涉及系膜細胞的增殖和腎小球ECM增多等[10]。腎系膜細胞是一類包繞微血管或毛細血管的特殊的平滑肌細胞，占腎小球固有細胞總數的30%～40%，可以提供腎小球的結構支撐，調控腎小球的濾過功能。在生長因子、炎癥因子、晚期糖基化終產物等因素刺激下系膜細胞過度分泌ECM，使ECM合成及降解失衡。系膜細胞發生肌成纖維細胞轉分化(myofibroblastic transdifferentiation，MFT)也參與內皮及足細胞損傷和繼發的小管間質損傷過程。因此腎系膜細胞在腎臟纖維化病灶的形成中具有重要作用[11-12]。α-SMA是系膜細胞發生肌成纖維細胞轉分化MFT的重要標志物，在腎纖維化發生發展中起重要作用，α-SMA不僅促進腎小球系膜細胞增殖，同時通過多個作用環節導致ECM過度聚積，引起腎小球系膜區擴張、毛細血管基底膜增厚，導致彌漫性或結節性腎小球硬化和腎纖維化，從而成為DKD的關鍵病理特征[13-14]。本研究發現，高糖可以升高HBZY-1細胞中α-SMA的表達，促進HBZY-1細胞的增殖。

近年來，大量研究發現microRNA也參與了DKD的發生發展，該家族中的miR-21是調控代謝、炎癥及纖維化的重要分子，普遍存在于腎臟纖維化疾病[15-17]。有研究發現，在DKD發展過程中，miR-21可直接作用于靶基因Smad7的3′-UTR部位，并且抑制其表達，從而促進DKD腎纖維化的進程[18-21]。本實驗結果顯示，高糖能使HBZY-1細胞內miR-21表達明顯增加。

在中醫學中，DKD按臨床表現屬于消渴并虛勞、腎勞、水腫等范疇，其基本病機為氣陰兩虛為本、痰瘀濁毒阻絡為標[22]。根據DKD這一基本病機特點創制的中醫復方糖通飲，是在六味地黃丸的基礎上改熟地黃為生地黃，并配伍黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成，既培補肝腎、調養氣陰，又除標實之痰濁、通腎絡之瘀阻[23]。根據現代藥理學研究證實，黃芪具有預防腎臟系膜細胞早期增殖及糖基化終產物介導的細胞凋亡的作用[24]；丹參對腎臟具有抗腎纖維化、減輕腎臟細胞損害的作用[25]。本實驗結果顯示，糖通飲中藥血清能降低HBZY-1細胞內miR-21 表達，增加Smad7 mRNA和蛋白的表達，降低α-SMA mRNA和蛋白表達，從而抑制HBZY-1細胞的增殖。表明糖通飲中藥血清可以抑制HBZY-1細胞增殖、減少ECM沉積，其作用機制可能與調節miR-21、Smad7以及α-SMA的表達有關，本研究找到了糖通飲防治DKD的新靶點，為經驗方糖通飲的臨床應用提供新的理論依據。