糖通飲含藥血清對高糖環(huán)境下HBZY-1細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制*

伏紅穎，潘艷伶，陳俞如，陳洪民

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 中醫(yī)學(xué)教研室，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 中醫(yī)科，貴州 貴陽 550000)

糖尿病(diabetic mellitus，DM)是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病[1]。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的第9版《IDF全球糖尿病概覽》顯示，預(yù)計到2045年，中國糖尿病患者數(shù)量將達(dá)到1.164億人[2]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease,DKD)患者最主要的病理改變之一是腎纖維化[3-4]。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的固有細(xì)胞之一，其增殖是導(dǎo)致DKD腎纖維化的重要因素[5]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)/Smad信號通路被公認(rèn)為在DKD的腎纖維化進(jìn)程中起著重要作用，DKD發(fā)生發(fā)展時，TGF-β1/Smad信號通路被過度激活，進(jìn)而引起腎小球系膜細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)(extracelluar matrix，ECM)的合成降解失衡，促進(jìn)腎臟纖維化[6-8]。在TGF-β1/Smad信號通路中，TGF-β1被認(rèn)為是腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化機(jī)制中最關(guān)鍵的細(xì)胞因子，Smad2和Smad3則是促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)組織纖維化的兩個主要下游調(diào)節(jié)因子[9-11]，因此，研究尋找抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖以及TGF-β1/Smad信號通路過度激活的有效藥物，對DKD的防治具有重要意義。本課題組前期動物及臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)，臨床經(jīng)驗方糖通飲可抑制DKD大鼠腎組織TGF-β1/Smad 信號通路的激活；改善早期DKD患者尿微量白蛋白、空腹血糖、血脂及糖化血紅蛋白，從而達(dá)到預(yù)防腎纖維化、延緩DKD發(fā)展為終末期腎病的效果[12-13]。本研究擬觀察在高糖環(huán)境下，糖通飲含藥血清對大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)增殖和TGF-β1/Smad信號通路的影響，探尋糖通飲體外細(xì)胞層面的分子作用機(jī)制，完善糖通飲防治DKD的作用機(jī)制，為糖通飲的臨床使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細(xì)胞 30只SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180±20) g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2020-0001；大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1，購自深圳Otwo Biotech公司。

1.1.2藥物 糖通飲顆粒劑，由廣東一方制藥有限公司提供，規(guī)格21 g/袋，組成藥物為生地、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、丹皮、黃芪、丹參、地骨皮、草決明。藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：生地(TS-QM-C094)、山藥(TS-QM-C347)、山茱萸(TS-QM-C350)、茯苓(TS-QM-C117)、澤瀉(TS-QM-C460)、丹皮(TS-QM-C-275)、黃芪(TS-QM-0179)、丹參(TS-QM-C085)、地骨皮(TS-QM-C093)、草決明(TS-QM-C215)。

1.1.3試劑 胰酶細(xì)胞消化液、DMEM正常糖培養(yǎng)基、Opti-MEM Reduced Serum Medium由GIBCO公司提供，青鏈霉素雙抗由HyClone公司提供，Western blot一抗稀釋液、RIPA裂解液、脫脂奶粉由Solarbio公司提供，特級胎牛血清(南美)由BI公司提供，RNA提取用Trizol購自thermo公司,細(xì)胞RNA提取試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，PVDF膜和Whatman濾紙購自Millipore公司，GAPDH抗體購自proteintech公司，TGF-β1一抗、Smad3一抗、Smad2一抗購自abcam公司，Phospho-Smad2一抗、Phospho-Smad3一抗均購自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IgG-HRP二抗購自proteintech公司。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞的傳代和培養(yǎng) 大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞鑒定后，選取第3～15代細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS的DMEM正常糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時吸去瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞3次，吸除廢液，用0.1%胰蛋白酶(1 mL)消化收集細(xì)胞1 min，10%培養(yǎng)基2 mL終止消化反應(yīng)，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，混勻后吸入新的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2含藥血清的制備 30只SPF級雄性SD大鼠，隨機(jī)分為空白對照組和糖通飲含藥血清組，每組15只；灌胃前將糖通飲顆粒劑按1 g/L的生藥濃度充分溶于雙蒸水中，以12.4 g/(kg·d)灌胃糖通飲含藥血清組大鼠(按照人體-大鼠體表面積比值換算)，空白對照組給予等體積的雙蒸水，連續(xù)給藥7 d。末次給藥1 h后，經(jīng)股動脈取血，血樣靜置2 h，4 ℃，3 000 r/min離心20 min，分離血清，60 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，過濾除菌，-80 ℃凍存。

1.2.3含大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基配制 以高糖+10%糖通飲含藥血清組培養(yǎng)基(30 mmol/L葡萄糖，50 mL)配制方法為例：稱取 0.220 7 g葡萄糖充分溶于 正常糖培養(yǎng)液45 mL 中，在超凈工作臺用過濾器過濾后，加入糖通飲含藥血清5 mL，顛倒混勻后分裝入5 mL離心管中，充分混勻后于-20 ℃或4 ℃儲存。

1.2.4實驗分組 收集到的大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞共分為正常糖+空白血清組(5.5 mmol/L葡萄糖+10%空白對照組大鼠血清)、高糖+空白血清組(30 mmol/L葡萄糖+10%空白對照組大鼠血清)以及高糖+糖通飲含藥血清組(30mmol/L葡萄糖+10%糖通飲含藥血清組大鼠血清)[14]，共3組。

1.2.5糖通飲含藥血清干預(yù) 選取第3～15代大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞懸液2 mL，待細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基換成含有相應(yīng)大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.6CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖情況 系膜細(xì)胞以3×104/mL接種于96孔板中，每孔體積100 μL，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基換成含有相應(yīng)大鼠血清的培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入0.5%的CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在搖床上溫柔的搖勻，用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長450 nm處吸光值，每組同時設(shè)置調(diào)零孔和對照孔。計算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=[(實驗組吸光值-空白組吸光值)/(對照組吸光值-空白組吸光值)]×100%。

1.2.7實時熒光定量PCR法檢測TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá) 收集培養(yǎng)的各組細(xì)胞，按Trizol說明書提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)上海翊圣公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按熒光定量PCR試劑盒檢測TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參，引物見表1，2-ΔΔCT計算各組基因相對表達(dá)量，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列及目的片段大小Tab.1 Primer sequence and target fragment size

1.2.8Western blot法檢測TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá) 將培養(yǎng)結(jié)束的六孔板拿出，吸去培養(yǎng)基，用含PMSF的裂解液提取上清液，BCA蛋白定量分析；4 ∶1加蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：制膠、上樣、電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 4 ℃孵育過夜；二抗常溫下孵育1 h，超敏發(fā)光液顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶，軟件ImageJ計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HBZY-1細(xì)胞的增殖情況

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組大鼠腎小球系膜HBZY-1細(xì)胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比較，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞增殖率降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖1 各組HBZY-1細(xì)胞的增殖情況(n=3)Fig.1 Proliferation of HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.2 HBZY-1細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組TGF-β1 mRNA表達(dá)增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖2 各組HBZY-1細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)(n=3)Fig.2 Expression of TGF-β1 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.3 HBZY-1細(xì)胞Smad2 mRNA表達(dá)

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組Smad2 mRNA表達(dá)增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞Smad2 mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖3 各組HBZY-1細(xì)胞Smad2 mRNA表達(dá)(n=3)Fig.3 Expression of Smad2 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.4 HBZY-1細(xì)胞Smad3 mRNA表達(dá)

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組Smad3 mRNA表達(dá)增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞Smad3 mRNA表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖4 各組HBZY-1細(xì)胞Smad3 mRNA表達(dá)(n=3)Fig.4 Expression of Smad3 mRNA in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.5 HBZY-1細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細(xì)胞 TGF-β1蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖5 各組HBZY-1細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)(n=3)Fig.5 Expression of TGF-β1 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.6 HBZY-1細(xì)胞p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)

與正常糖+空白血清組相比，高糖+空白血清組細(xì)胞p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖6 各組細(xì)胞p-Smad2/Smad2蛋白表達(dá)(n=3)Fig.6 Expression of p-Smad2/Smad2 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

2.7 HBZY-1細(xì)胞p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)

與正常糖+空白血清組比較，高糖+空白血清組細(xì)胞p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與高糖+空白血清組相比，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

注：(1)與正常糖+空白血清組比較，P<0.05；(2)與高糖+空白血清組比較，P<0.05。圖7 各組HBZY-1細(xì)胞p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)(n=3)Fig.7 Expression of p-Smad3/Smad3 proteins in HBZY-1 cells in each group(n=3)

3 討論

研究表明，系膜細(xì)胞增殖在DKD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，過度增殖的系膜細(xì)胞可通過多種途徑影響腎臟功能且與腎纖維化密切相關(guān)[15]。TGF-β1/Smad作為DKD發(fā)生發(fā)展最主要的信號通路，它的激活對DKD腎間質(zhì)纖維化起著重要的促進(jìn)作用[16]。該通路中的TGF-β1是DKD發(fā)病過程的中心環(huán)節(jié)，處于DKD相關(guān)生長因子網(wǎng)絡(luò)中心地位[17]，在DKD發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1通過刺激系膜細(xì)胞活化增殖，分泌大量的Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原及纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分，導(dǎo)致ECM的堆積。此外，TGF-β1的過度表達(dá)，還可刺激金屬蛋白抑制劑產(chǎn)生，抑制膠原酶的合成，從而使ECM降解減少，有利于ECM在腎臟的積聚，促進(jìn)DKD的發(fā)生發(fā)展[18-19]。Smads蛋白是介導(dǎo)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白，分為受體激酶、通用型和抑制型三種。Smad2和Smad3屬于受體激酶，是促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)組織纖維化的2個主要下游調(diào)節(jié)因子，當(dāng)DKD發(fā)生發(fā)展時，TGF-β1先與Ⅱ型受體(TβRⅡ)結(jié)合，磷酸化Ⅰ型受體(TβRI)，進(jìn)一步激活下游Smad3信號，促進(jìn)Smad復(fù)合物產(chǎn)生，入核并干擾相關(guān)基因的表達(dá)，比如ECM成分纖連蛋白(FN1)和膠原蛋白等，從而進(jìn)一步加重DKD腎纖維化程度[20]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBZY-1細(xì)胞在高糖刺激下明顯增殖，且細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)升高，TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)升高，提示TGF-β1/Smad通路的激活參與了高糖環(huán)境對HBZY-1細(xì)胞的損害。

中醫(yī)學(xué)中無DKD這一病名，但按其臨床表現(xiàn)當(dāng)隸屬于消渴病并虛勞、腎勞、水腫等范疇，消渴病的基本病機(jī)為陰虛燥熱，發(fā)展日久則氣陰兩虛、瘀血內(nèi)生，且陰虛日久、陰損及陽、陰陽俱虛，導(dǎo)致臟腑功能受損而致濁毒內(nèi)停[21]，最終形成DKD氣陰兩虛為本、痰瘀濁毒阻絡(luò)為標(biāo)的基本病機(jī)特點。有研究指出，根據(jù)DKD這一基本病機(jī)特點創(chuàng)制了中藥復(fù)方糖通飲，該方是在六味地黃丸的基礎(chǔ)上易熟地黃為生地黃，伍入黃芪、丹參、地骨皮、草決明而成[22]。本研究所采用的糖通飲是以黃芪為君，生地黃、山藥、山茱萸為臣，培補(bǔ)肝腎、調(diào)養(yǎng)氣陰以固本虛；佐以茯苓、牡丹皮、澤瀉、丹參、地骨皮、草決明，除標(biāo)實之痰濁，通腎絡(luò)之瘀阻；諸藥合用，標(biāo)本兼治，益氣養(yǎng)陰保腎，活血化瘀通絡(luò)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪中的黃芪甲甙及黃芪多糖兩種主要活性成分，具有降低血糖、減輕蛋白尿以及保護(hù)腎臟功能的作用[23]；丹參中的酚酸類和二萜醌類成分可以抑制腎纖維化和炎癥，減輕臨床患者的尿蛋白排泄率[24]；地骨皮、草決明可降糖降脂[25]。糖通飲已在臨床使用多年，并且取得了較為肯定的療效[26]，但其作用機(jī)制仍不十分明確。本研究結(jié)果顯示，與高糖+空白血清組比較，高糖+糖通飲含藥血清組細(xì)胞增殖被抑制，HBZY-1細(xì)胞中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)降低，TGF-β1、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3蛋白表達(dá)均有不同程度的降低，說明該方可緩解高糖環(huán)境對HBZY-1細(xì)胞的損害，并抑制TGF-β1/Smad通路的激活。

綜上，本實驗首次采用中藥血清藥理學(xué)方法，從細(xì)胞層面證實了糖通飲可以抑制高糖狀態(tài)下大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad信號通路的過度激活有關(guān)。