吡哆胺與辛伐他汀對糖尿病大鼠神經病理性疼痛的影響及內分泌調控意義

呂春鳳 (天津市北辰醫院,天津 300400)

神經病理性疼痛屬于神經科常見癥狀之一，是指在沒有外界刺激的條件下而感到的疼痛，是軀體感覺系統病變或疾病所直接導致的疼痛[1-2]。通常認為該病癥與炎性反應、血管病、腫瘤、外傷、糖尿病、頸椎病、卟啉病、真性紅細胞增多癥、中毒、精神性因素等有關[3]。臨床數據顯示在我國糖尿病患者中，有高達約45%的患者會發生糖尿病神經病理性疼痛(DNP)，且發病率隨著糖尿病患者時間的延長而增加[4-5]。DNP主要是指以肢體遠端受累為主的對稱性周圍神經病理學疼痛及自主神經異常，臨床表現包括麻木、肌肉深部疼痛、平衡障礙、燒灼樣及電擊樣疼痛、痛覺過敏等現象[6]。目前仍然需要進一步完善糖尿病神經病理性疼痛的診治手段。臨床治療DNP的藥物主要包括抗痙攣藥物、抗抑郁藥物及阿片類藥物，一般是通過給藥控制患者機體的血糖水平和針對性干預患者病理生理機制[7-8]。其中吡哆胺是具有維生素B6作用的自然物質之一，且臨床效應要比維生素B6大數千倍。在已有研究報道中吡哆胺可用于改善糖尿病大鼠的腎臟功能和抑制糖尿病視網膜病變機制，因此推測吡哆胺對于糖尿病并發癥起到很好的治療效果[9]。辛伐他汀屬于他汀類藥物中的一種，除了傳統應用于降低膽固醇、抗炎、鈣離子通道調節之外，還被應用于坐骨神經壓傷、慢性壓迫性損傷等動物模型中，發現辛伐他汀能夠在一定程度上緩解神經病理性疼痛的癥狀[10-11]。因此，本研究選取40只雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠作為研究對象，將其中30只構建為糖尿病大鼠模型，根據不同給藥方式來綜合評價吡哆胺和辛伐他汀在DNP大鼠給藥治療中的應用效果及內分泌因子的表達。

1 資料與方法

1.1實驗動物：本研究選取培育8～10周的40只健康雄性SD大鼠作為研究對象，體重180～220 g，飼養于25℃左右的動物房中，每天照明12 h，定期喂養食物和水。該研究按照實驗方案開展實驗，嚴格規范操作流程，不違背倫理要求。

1.2糖尿病大鼠模型的構建及治療： 根據給藥方式的不同將大鼠分為D0組(正常對照)、D1組(給予吡哆胺)、D2組(給予辛伐他汀)、D3組(無菌水)，然后將D1組、D2組、D3組大鼠禁食12 h，禁水6 h，給各組大鼠腹腔注射一次性的60 mg/kg鏈脲佐菌素，3 d后通過剪尾法測定大鼠的血糖水平，當血糖>16.8 mmol/L即為建模成功。建模成功后，每天給大鼠予以200 mg/kg的吡哆胺或辛伐他汀進行灌胃處理，記錄大鼠第0、1、2、4、6、8天的血糖水平和體重變化。

1.3大鼠疼痛反應檢測：①機械疼痛檢測：本研究采用北京友誠嘉業生物科技有限公司生產的電子測痛儀(Electric VonFrey)檢測各組大鼠的機械刺激縮足反射閾值(PWMT)，測量前先讓大鼠在籠中適應30 min，然后將籠子放在金屬網鐵架上，測量開始后用金屬頭向大鼠后足底加壓刺激，大鼠出現縮足反應后記錄加壓刺激的最大值，記錄3次。②熱閾痛檢測：本研究采用四川佐誠科技有限公司生產的全自動熱輻射刺激儀檢測各組大鼠的熱刺激縮足反應潛伏期(PWTL)，測量前先讓大鼠在籠中適應30 min，然后將籠子放在金屬網鐵架上，測量開始后用激光儀照射大鼠足后底，大鼠突然抬足時即可停止并記錄照射時間，記錄3次。

1.4RAGE和p-NF-kB蛋白表達檢測：本研究采用免疫熒光染色檢測大鼠脊髓背角組織星形膠質細胞的晚期糖基化終產物受體(RAGE)和p-NF-kB蛋白表達。具體步驟：①將大鼠腰段脊髓組織制備成冰凍切片，室溫下放置20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次；②將切片放置于1%的Triton X-100溶液培養20 min，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次；③將切片放在抗原修復液中20 min，用牛血清白蛋白培養1 h，棄掉封閉液，加入對應的一抗工作液，4℃過夜；④用磷酸鹽緩沖液洗滌3次后加入對應的熒光二抗，室溫環境培養1 h，完成后棄掉二抗工作液，用防熒光猝滅封片劑封片。用熒光顯微鏡觀察拍照，采用ImageJ version 1.36b計算RAGE和p-NF-kB蛋白陽性表達率。

1.5FGF-2蛋白檢測：本研究采用免疫組染檢測FGF-2水平。具體步驟：①首先將大鼠背根神經節固定、包埋、連續切片，60℃烘干備用；②利用微波修復，磷酸鹽緩沖液洗滌3次；③3%的去離子水培育15 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入稀釋好的一抗FGF-2，4℃下過夜；④加入聚合物輔助劑培育20 min，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，再加入生物素標記的抗兔聚合物37℃培養30 min；⑤加入二氨基聯苯胺(3,3'-diaminobenzidine)顯色30 min，自來水沖洗，中性樹膠封片。用武漢億凡光電有限公司生產的Olympus顯微鏡下選取10個高清視野區域，觀察并記錄陽性細胞，采用福州邁新生物技術開發有限公司生產的HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統自動計算陽性單位(PU值)。

1.6統計學分析:本研究數據處理采用SPSS 19.0版本統計軟件對數據進行處理，D0、D1、D2、D3組大鼠的血糖、體重、PWMT、PWTL、RAGE、p-NF-kB蛋白表達、FGF-2S水平比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.14組大鼠血糖及體重變化:圖1為1周內4組大鼠血糖及體重變化，可以看出D1、D2、D3組大鼠在1周內的血糖及體重變化并不明顯，始終處于平穩狀態，且3組間比較差異無統計學意義(P>0.05)；D0組大鼠在1周內的血糖始終D1、D2、D3組，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：A為4組大鼠血糖；B為4組大鼠體重；①表示相較于D0組，P<0.05圖1 4組大鼠血糖及體重變化

2.24組大鼠疼痛閾值比較：D0組大鼠的PWMT、PWTL 1周內未發生明顯變化；D3組大鼠的PWMT、PWTL 1周內隨時間推移而明顯下降，且顯著低于D0、D1、D2組，差異有統計學意義(P<0.05)；D1、D2組大鼠的PWMT、PWTL 1周內隨時間推移而稍有下降，但兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：A為4組大鼠PWMT；B為4組大鼠PWTL；①表示相較于D3組，P<0.05圖2 4組大鼠疼痛閾值比較

2.34組大鼠RAGE蛋白表達：如圖3所示，D3組大鼠的 RAGE蛋白陽性表達率明顯高于D1、D2組，且差異有統計學意義(P<0.05)；D0組大鼠的 RAGE蛋白陽性表達率明顯低于D1、D2組，且差異有統計學意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠的 RAGE蛋白陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。圖4為4組大鼠星形膠質細胞RAGE熒光染色結果，圖4A可見星形膠質細胞亮度較低，RAGE蛋白陽性表達的細胞數量明顯較少。圖4D可見RAGE蛋白陽性表達的細胞數量明顯較多，亮度較大，高于圖4B、C。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05圖3 4組大鼠RAGE蛋白陽性表達率

注：A為D0組熒光染色；B為D1組熒光染色；C為D2組熒光染色；D為D3組熒光染色圖4 4組大鼠星形膠質細胞RAGE熒光染色結果(×200)

2.44組大鼠p-NF-κB蛋白陽性表達：如圖5所示，D3組大鼠的p-NF-κB蛋白陽性表達率明顯高于D1、D2組，差異有統計學意義(P<0.05)；D0組大鼠的p-NF-κB蛋白陽性表達率明顯低于D1、D2組，差異有統計學意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠的p-NF-κB蛋白陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)。圖6為4組大鼠星形膠質細胞p-NF-κB熒光染色結果，圖6A可見星形膠質細胞亮度較低，p-NF-κB蛋白陽性表達的細胞數量明顯較少。圖6D可見p-NF-κB蛋白陽性表達的細胞數量明顯較多，亮度較大。圖6B、C的p-NF-κB蛋白陽性表達的細胞數量相差不大。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05

注：A為D0組熒光染色；B為D1組熒光染色；C為D2組熒光染色；D為D3組熒光染色圖6 4組大鼠星形膠質細胞p-NF-κB熒光染色結果(×200)

2.54組大鼠FGF-2蛋白陽性表達：D3組大鼠的FGF-2蛋白PU值明顯高于D1、D2、D3組，差異有統計學意義(P<0.05)；D0組大鼠的FGF-2蛋白PU值表達率明顯低于D1、D2組，差異有統計學意義(P<0.05)；D1組和D2組大鼠FGF-2蛋白PU值比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖7。圖8A、8B、8C、8D為4組大鼠FGF-2蛋白免疫組染結果。圖8D可見大鼠背神經節細胞中存在大量的FGF-2蛋白陽性細胞，陽性主要分布在胞核中，著色均為大片的黃色、棕黃色。圖8B、C可見部分FGF-2蛋白陽性細胞，著色為藍色或棕黃色，陽性主要分布于胞核中。圖8A可見FGF-2蛋白陽性細胞較少，出現不少藍色細胞區域。見圖7。

注：①表示相較于D3組，P<0.05；②表示相較于D0組，P<0.05圖7 4組大鼠FGF-2蛋白陽性表達

注：A為D0組免疫組染；B為D1組免疫組染；C為D2組免疫組染；D為D3組免疫組染圖8 4組大鼠FGF-2蛋白免疫組染圖(×400)

3 討論

疼痛疾病是一種世界性難題，其中糖尿病神經病理性疼痛作為常見的糖尿病并發癥狀，是由于多種途徑的綜合作用，包括多元醇途徑、蛋白激酶C途徑、晚期糖基化終末產物代謝途徑等，這些途徑都可能引發機體炎性反應、基因表達改變、線粒體功能失衡，最終導致糖尿病神經病變[12]。吡哆胺和辛伐他汀都是目前臨床研究中可能對于糖尿病神經病理性疼痛產生治療效果的藥物[13]，所以本研究將8～10周的30只健康雄性SD大鼠構建了糖尿病神經病理性疼痛模型，并給予吡哆胺和辛伐他汀進行藥物治療。結果與陳波等[14]的研究結果相類似，表明吡哆胺和辛伐他汀兩種藥物對于糖尿病大鼠的血糖及體重都沒有產生顯著影響。與正常對照組相比，糖尿病大鼠建模后表現出多食、多飲、多尿的表現，毛發變黃，活力下降[15]。D3組大鼠的PWMT、PWTL 1周內隨時間推移而明顯下降，且顯著低于D0、D1、D2組，說明吡哆胺和辛伐他汀都能有效改善機械疼痛閾值，減輕大鼠的機械痛敏及熱痛閾。D1、D2組大鼠的PWMT、PWTL 1周內隨時間推移而稍有下降，但兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)，這說明吡哆胺和辛伐他汀對于大鼠的機械痛敏和熱痛閾改善效果相近[16]。

D3組大鼠的 RAGE蛋白陽性表達率明顯高于D1、D2組，D1組和D2組大鼠的 RAGE蛋白陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，這與劉星玥等[17]的研究結果相類似，表明糖尿病會導致大鼠脊髓背角中的RAGE表達升高，而吡哆胺和辛伐他汀都能夠在一定程度上降低RAGE的過表達，且改善效果相近。D3組大鼠的 p-NF-κB蛋白陽性表達率明顯高于D1、D2、D3組，D1組和D2組大鼠的p-NF-κB的蛋白陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)，這同樣表明吡哆胺和辛伐他汀對于p-NF-κB的激活有著較強的抑制作用，改善大鼠的神經病變[18]。D3組大鼠的FGF-2蛋白PU值明顯高于D1、D2、D3組，D1組和D2組大鼠FGF-2蛋白PU值比較差異無統計學意義(P>0.05)，這與于婷等[19]的研究結果存在差異。成纖維細胞生長因子是分泌蛋白家族的一大種類，已有研究證實其可以通過自分泌、內分泌等途徑參與機體內多種不同的生理生化反應，而FGF-2作用其中一種內分泌因子，也在糖尿病大鼠內分泌調控中起到了相應作用[20]。由此，結果表明正常大鼠的FGF-2蛋白表達較低，而糖尿病大鼠呈現高表達狀態，提示FGF-2參與了大鼠神經病理疼痛的產生和維持，而吡哆胺和辛伐他汀則可以降低FGF-2的表達。

本研究將8～10周的30只健康雄性SD大鼠構建了糖尿病神經病理性疼痛模型，并分別給予吡哆胺和辛伐他汀進行藥物治療，10只正常大鼠作為對照。通過比較各組大鼠的機械疼痛、熱閾痛、RAGE、FGF-2和p-NF-κB蛋白表達，結果發現內分泌因子FGF-2參與了大鼠神經病理疼痛的產生和維持。吡哆胺和辛伐他汀能夠通過抑制RAGE、p-NF-κB的激活及FGF-2蛋白的表達，來有效減輕糖尿病大鼠的機械痛敏及熱閾痛，且改善效果相近。但是本研究并沒有更為細致的劃分吡哆胺和辛伐他汀的用量，來探討最佳用藥量的選擇，后續考慮加大大鼠的樣本量，做進一步分析。總之，本研究結果為糖尿病神經病理性疼痛的治療提供了理論基礎。