刺五加多糖納米乳對(duì)免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)作用

李向輝 ， 黃 慧 ， 周延州 ， 閆盼盼 ， 李清苗 ， 黃蓮菊 ， 馬 霞

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046)

刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)是從五加科植物刺五加中提取出來的具有藥效活性的成分[1]。它可以激活并促進(jìn)免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的免疫活性[2-4]。袁學(xué)千等[5]研究發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖可明顯提高正常小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，促進(jìn)腸系膜細(xì)胞增多，恢復(fù)免疫抑制小鼠的免疫功能；張英楠[6]研究發(fā)現(xiàn)，刺五加多糖對(duì)雞具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)脾臟、胸腺的發(fā)育和巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目的增多。目前，關(guān)于刺五加多糖的制劑很少，未見有關(guān)刺五加多糖納米乳(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide-nanoemulsion，ASPS-NE)對(duì)免疫抑制小鼠方面的研究。本試驗(yàn)在前期制備刺五加多糖納米乳的基礎(chǔ)上[7]，利用環(huán)磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，通過對(duì)其胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定、脾細(xì)胞增殖活性檢測(cè)、碳廓清試驗(yàn)、NK細(xì)胞活性檢測(cè)等來研究刺五加多糖納米乳對(duì)免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)效果，從而為獸醫(yī)臨床提供一種新型有效的免疫增強(qiáng)劑，也為利用納米技術(shù)開發(fā)中藥免疫增強(qiáng)劑提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 刺五加多糖，購(gòu)自西安小草植物科技有限公司(產(chǎn)地遼寧沈陽(yáng)，多糖含量95%)；環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液，購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；10%胎牛血清，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8，購(gòu)自日本東仁化學(xué)科技公司；印度墨汁，購(gòu)自北京恒奧德科技有限公司；刺五加多糖納米乳(ASPS-NE)、空白納米乳、刺五加多糖水溶液(ASPS)，均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 主要儀器 倒置生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)，上海儀田精密儀器公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，鄭州生元儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 SPF級(jí)BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周 齡，體重(18±2)g，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK (豫)2020—0052]，小鼠自由采食和飲水，飼養(yǎng)溫度：(25±1) ℃、 相對(duì)濕度：40%±10%、光周期控制：12 h光-暗循環(huán)。YAC-1細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將70只BALB/c小鼠隨機(jī)分成7個(gè)組，每組10只，分別為ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組、ASPS-NE低劑量組、空白納米乳組、CTX模型組和正常對(duì)照組。ASPS水溶液組以50 mg/(kg·bw)的劑量皮下注射ASPS水溶液；ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組分別以100、50 mg/(kg·bw)和25 mg/(kg·bw)的藥物劑量皮下注射ASPS-NE；正常對(duì)照組以0.1 mL/(10 g·bw)體重皮下注射生理鹽水；空白納米乳組以50 mg/(kg·bw)的用量皮下注射空白納米乳,每日1次，連用7 d。

另外，除正常對(duì)照組外，其余各組在第1、2天和第5天均按照80 mg/(kg·bw·d)的劑量皮下注射環(huán)磷酰胺，共3次，末次給藥24 h后將小鼠采用安樂死的方法致死后采集脾臟、胸腺等器官，收集脾細(xì)胞進(jìn)行脾細(xì)胞增殖活性檢測(cè)，在動(dòng)物試驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利倫理的相關(guān)要求，減少對(duì)動(dòng)物的應(yīng)激和痛苦，采用對(duì)動(dòng)物痛苦最少的方式進(jìn)行處置。

1.4.2 免疫器官指數(shù)的測(cè)定 末次給藥12 h后，取每組小鼠并稱重，做好記錄，將小鼠脫頸處死，取出每只小鼠的脾臟和胸腺，分別稱重記錄，最后按照公式(1)計(jì)算每組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

公式(1)

1.4.3 脾細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 末次給藥12 h后，無菌采集小鼠脾臟進(jìn)行研磨，用小鼠淋巴細(xì)胞分離液收集脾細(xì)胞，制成密度為5×105個(gè)/mL的脾細(xì)胞懸液。按照分組情況，在96孔板中先加入脾細(xì)胞懸液，每孔100 μL，再分別加入含ConA(終濃度為5 μg/mL) 或者LPS(終濃度為10 μg/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)液，每孔100 μL。同時(shí)設(shè)立只加入200 μL RPMI-1640培養(yǎng)液的空白對(duì)照組。在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度(OD值)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.4.4 單核巨噬細(xì)胞的吞噬活性檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8] 方法進(jìn)行碳廓清試驗(yàn)檢測(cè)。末次給藥12 h后，在小鼠尾靜脈注射印度墨汁(以生理鹽水按1∶5稀釋)0.2 mL，注射完之后馬上開始計(jì)時(shí)，分別在注射后的第2分鐘(t1)和第10分鐘(t2)進(jìn)行眼眶采血，并將采集的血液(20 μL)加到2 mL 0.1% 的Na2CO3溶液中，搖勻，以此作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的吸光度OD值。處死小鼠后取出肝臟和脾臟，處理干凈后進(jìn)行稱重，按公式(2)計(jì)算吞噬指數(shù)(α)。

公式(2)

其中，A1和A2分別為t1和t2時(shí)的吸光度OD值。

1.4.5 自然殺傷(NK)細(xì)胞活性檢測(cè) 無菌條件下取出復(fù)蘇好的YAC-1細(xì)胞，向其中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋，制成密度為1×104個(gè)/mL 的YAC-1細(xì)胞懸液，作為靶細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞是制備的脾細(xì)胞懸液。試驗(yàn)分為試驗(yàn)孔、靶細(xì)胞對(duì)照孔、效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔，試驗(yàn)孔中加入脾細(xì)胞懸液和YAC-1細(xì)胞懸液各100 μL；靶細(xì)胞對(duì)照孔加入YAC-1細(xì)胞懸液和RPMI-1640培養(yǎng)液各100 μL；效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔加入脾細(xì)胞懸液和RPMI-1640培養(yǎng)液各100 μL；空白對(duì)照孔每孔只需加入200 μL 的RPMI-1640 培養(yǎng)液，重復(fù)3孔。然后將制備好的96孔板放在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h后，取出向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度OD值。NK細(xì)胞活性通常用NK細(xì)胞殺傷率表示，按照公式(3)計(jì)算。

公式(3)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響 結(jié)果如表1所示，與正常對(duì)照組相比，CTX模型組的脾臟和胸腺指數(shù)均極顯著減小(P<0.01)，說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功；與CTX模型組相比，空白納米乳組對(duì)免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)影響不明顯(P>0.05)，而ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組、ASPS-NE低劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均極顯著提高(P<0.01)； 與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE高劑量組的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)顯著提高(P<0.05),ASPS-NE中劑量組的指數(shù)極顯著提高(P<0.01)。

表1 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.2 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 結(jié)果如表2所示，與正常對(duì)照組相比，CTX模型組由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖活性(OD值)均極顯著減小(P<0.01)，說明環(huán)磷酰胺免疫抑制模型建模成功；與 CTX模型組相比，ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組和ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖活性(OD值)均極顯著增高(P<0.01)，而且ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖的活性更強(qiáng)；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)效果極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，ASPS-NE高、中、低劑量組均能顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性，尤其是ASPS-NE中劑量的效果更佳。

表2 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性的影響

2.3 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的影響 結(jié)果如表3所示，與正常對(duì)照組相比，CTX模型組的吞噬指數(shù)極顯著降低(P<0.01)；與 CTX模型組相比，ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組的吞噬指數(shù)極顯著增高(P<0.01)，ASPS水溶液組的吞噬指數(shù)顯著增高(P<0.05)；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組的吞噬指數(shù)極顯著增高(P<0.01)，ASPS-NE低劑量組的吞噬指數(shù)顯著增高(P<0.05)。結(jié)果表明，ASPS-NE高、中、低劑量組均能顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠單核吞噬細(xì)胞的指數(shù)，尤其是ASPS-NE中劑量的效果更佳。

表3 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的影響

2.4 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠脾臟NK細(xì)胞活性的影響 結(jié)果如表4所示，與正常對(duì)照組相比，CTX模型組、空白納米乳組的NK細(xì)胞殺傷率均極顯著降低(P<0.01)，說明小鼠免疫抑制劑模型造模成功；與CTX組模型相比，ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組的NK細(xì)胞殺傷率均極顯著升高(P<0.01)，尤其是ASPS水溶液組、ASPS-NE中劑量組的NK細(xì)胞殺傷率升高更快，接近于正常對(duì)照組水平；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組的NK細(xì)胞殺傷率極顯著升高(P<0.01)，其他組都呈降低水平。結(jié)果表明，ASPS-NE可以顯著增強(qiáng)免疫抑制小鼠的NK細(xì)胞活性，而且ASPS-NE中劑量的效果比ASPS水溶液更佳。

表4 ASPS-NE對(duì)免疫抑制小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 討論

脾臟和胸腺是機(jī)體發(fā)揮免疫作用的關(guān)鍵組織，常用其指數(shù)的高低來反映免疫器官發(fā)育的程度，脾臟和胸腺發(fā)育越好，質(zhì)量越大，機(jī)體的免疫能力越強(qiáng)。環(huán)磷酰胺常用來建立免疫抑制動(dòng)物模型，其會(huì)損害小鼠的肝臟，降低小鼠的脾臟和胸腺的免疫指數(shù)[9-10]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，CTX模型組的脾臟和胸腺的臟器指數(shù)明顯下降；相反，ASPS-NE高、中、低劑量組的臟器指數(shù)與CTX模型組相比有不同程度的明顯升高。單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)具有免疫防御功能，能夠吞噬機(jī)體內(nèi)異常的物質(zhì)，清除對(duì)機(jī)體有害的物質(zhì)。碳廓清試驗(yàn)中，碳粒的清除速率能夠表明機(jī)體的吞噬能力[11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，ASPS-NE 能明顯增強(qiáng)免疫抑制小鼠的單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)，增強(qiáng)其吞噬能力，ASPS-NE 中劑量組的單核巨噬細(xì)胞的吞噬效果極顯著強(qiáng)于ASPS水溶液組。這些結(jié)果與翟旭楠等的研究結(jié)果相似，該研究小組采用CTX誘發(fā)免疫抑制模型來研究刺五加多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn) ASPS 用藥組的臟器指數(shù)與模型組相比顯著提高(P<0.05)，吞噬指數(shù)極顯著提高(P<0.01)[12]。以上結(jié)果表明 ASPS-NE與ASPS水溶液都能促進(jìn)臟器指數(shù)升高，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，ASPS-NE 的效果優(yōu)于ASPS水溶液，尤其是中劑量ASPS-NE的效果更佳。因此，推斷ASPS-NE 可能通過激活巨噬細(xì)胞適應(yīng)性免疫和先天免疫發(fā)揮作用。

脾臟是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要免疫器官之一，由 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞組成。脾淋巴細(xì)胞增殖是細(xì)胞免疫功能最直接的指標(biāo)。可以通過探討ASPS-NE對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖的影響，研究其免疫增強(qiáng)作用。ConA、LPS分別可以刺激不同的淋巴細(xì)胞亞型，T 淋巴細(xì)胞對(duì) ConA 敏感，B 淋巴細(xì)胞對(duì) LPS 敏感[13]。因此，淋巴細(xì)胞增殖率是量化多糖免疫增強(qiáng)活性強(qiáng)弱的指標(biāo)[14]。本試驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)脾細(xì)胞的增殖情況，在使用ConA和LPS作為誘導(dǎo)劑刺激脾細(xì)胞增殖過程中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，CTX 處理可以降低小鼠 T 淋巴細(xì)胞的增殖。經(jīng)ASPS-NE處理后，淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)逐漸恢復(fù)到正常水平。ASPS-NE中劑量組脾細(xì)胞增殖效果最強(qiáng)，提示 ASPS-NE 通過抗原特異性促進(jìn)脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與Li 等的研究結(jié)果相似，該研究小組發(fā)現(xiàn)淫羊藿多糖可以顯著促進(jìn) CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制雞的淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)免疫應(yīng)答[15]。此外有研究發(fā)現(xiàn)許多中藥多糖能夠逆轉(zhuǎn) CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力[16]。

外周血、肝臟、脾臟是NK細(xì)胞常常存在的部位。NK細(xì)胞可以清除病變細(xì)胞，延緩細(xì)胞的衰老，極大的提高機(jī)體免疫力。當(dāng)機(jī)體感染病毒以后，NK細(xì)胞發(fā)生活化，產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用。NK細(xì)胞可以識(shí)別靶細(xì)胞，活化吞噬細(xì)胞，殺傷介質(zhì)，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力[17-18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ASPS-NE能夠提高NK細(xì)胞的殺傷率，即能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫活性，而且ASPS-NE中劑量的效果比ASPS水溶液更佳。這同樣表明ASPS-NE可通過提高NK細(xì)胞的殺傷率，增強(qiáng)NK細(xì)胞的免疫活性來發(fā)揮免疫增強(qiáng)的效果。