豬流行性腹瀉疫苗不同免疫程序的效果評估

齊海濤 ， 王 利 ， 楊學剛 ， 楊耀智 ， 郭 鑫

(1. 中國農業大學動物醫學院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 黑龍江大北農農牧食品有限公司 ， 黑龍江 哈爾濱 150021 ； 3. 新希望六和股份有限公司 ， 北京 海淀 100102)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarthea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarthea virus,PEDV)引起的病毒性傳染病，以引起仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征，7日齡內仔豬表現高死亡率。20世紀90年代以來，我國開發了以CV777毒株為原型的滅活疫苗，其廣泛使用控制了PED的大規模流行，使該病呈零星暴發和區域性感染。直到2010年10月，我國南部省份暴發PED，Wang等[1]首次報道了PEDV的新變異株，自此之后在全國各個省份都有流行，仔豬感染PEDV死亡率高達80%以上，給養殖業造成巨大的經濟損失。2018—2019年對我國廣東省的8個養豬場進行采樣檢測腸道病原體，PEDV的檢出率為47.0%(16/34)[2]。在此次調查中研究人員還發現，廣東流行的PEDV毒株存在S基因的重組，因此迫切需要開發新疫苗以應對新的PEDV變異毒株。

關于PED疫苗免疫有效性的說法眾說紛紜,對疫苗免疫后效果的評估較少。目前控制仔豬PED尚無有效治療藥物，選擇合適的疫苗及合理的免疫程序是預防PED的重要措施。有研究表明，豬流行性腹瀉的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的分泌型母源IgA抗體與仔豬抵抗PEDV感染呈正相關，而與血液中的IgG抗體相關性較低[3]。朱海俠等[4]研究表明，乳汁中PEDV IgA抗體與血清IgA抗體呈現很好的相關性，且乳汁中 IgA抗體水平遠遠高于血清。因此，如何刺激動物機體產生高水平的分泌型IgA抗體，是PED疫苗免疫以及PED防控的關鍵。本試驗通過對比不同類型疫苗以不同時間、不同組合接種妊娠母豬，評估疫苗免疫對母豬初乳中IgA抗體含量及持續時間的影響，以期為規模化豬場新生仔豬PED的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯活疫苗(簡稱豬腹瀉二聯活苗)，購自福州大北農生物技術有限公司，生產批號：130141109；豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯滅活疫苗(簡稱豬腹瀉二聯滅活苗)，購自武漢科前生物股份有限公司，生產批號：170041124；豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒，購自美國愛德士公司，生產批號：56D230。

1.2 主要儀器設備 酶標儀、恒溫培養箱、多道移液器、臺式高速冷凍型微量離心機、醫用冷藏柜HYC-650等。

1.3 實驗動物 大北農集團唐山種豬場健康妊娠母豬，經檢測PEDV抗原、抗體均為陰性。

1.4 試驗設計

1.4.1 PED疫苗不同組合免疫效果評估 2017年9月—2018年9月，選取PEDV抗原、抗體陰性健康妊娠母豬125頭，平均分成5個組，每組25頭。第1組：2次豬腹瀉二聯滅活苗免疫(產前40 d、20 d)；第2組：2次豬腹瀉二聯活苗免疫(產前40 d、20 d)；第3組：1次豬腹瀉二聯活苗免疫(產前40 d)+1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫(產前20 d)；第4組：2次豬腹瀉二聯活苗免疫(產前60 d、40 d)+1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫(產前20 d)；對照組：2次疫苗稀釋液免疫注射(產前40 d、20 d)。試驗疫苗用法與用量：豬腹瀉二聯滅活疫苗，妊娠母豬后海穴注射，每次4 mL;豬腹瀉二聯活苗，妊娠母豬后海穴注射，每次1頭份；對照組妊娠母豬后海穴注射4 mL 疫苗稀釋液。母豬產仔當天收集乳汁2 mL，用ELISA方法檢測初乳中IgA抗體值。

1.4.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA抗體持續時間測定 對第2組和第4組的母豬隨機選取10頭，分別在產后3、6、9、12 d和15 d收集乳汁，檢測乳汁中IgA抗體，評估IgA抗體持續時間。

1.4.3 乳汁中PEDV的IgA抗體測定與計算 按照抗體檢測試劑盒說明書對所有試驗母豬初乳中PEDV IgA抗體進行檢測。(1) 檢測的有效性：①陰性對照OD650 nm(NC)平均值<0.200；②陽性對照OD650 nm(PC)平均值>0.500，上述任何一個值超出規定的范圍，則該試驗被視為無效，所檢的樣品需要重新進行檢測；(2)計算：按照豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒說明書計算樣品與陽性對照(S/P)的比值。結果判定：陰性S/P<0.50；陽性S/P≥0.50。

2 結果

2.1 PED疫苗不同組合免疫后乳汁中IgA抗體檢測 結果如表1所示，4個免疫組中第2組和第4組的免疫組合效果較好，抗體陽性率分別為93.75%和97.50%，陽性平均OD值分別為1.535和1.447，免疫后誘導機體產生的IgA抗體整齊度好；第1組IgA抗體陽性率最差，為38.13%；第3組IgA抗體陽性率為80%，免疫效果居中。

表1 不同免疫程序的IgA抗體陽性率與平均OD值

2.2 免疫后乳汁中PEDV的IgA 抗體持續時間

2.2.1 2次豬腹瀉二聯活苗免疫IgA持續時間檢測 結果如表2所示，2次豬腹瀉二聯活苗免疫組(第2組)母豬乳汁中IgA抗體在前6天陽性率為100%，第9天陽性率開始下降至80%，第12天降至70%，第15天降至10%，在豬群中10%的仔豬有抗體，對于抵抗病毒感染基本不起作用；IgA抗體可持續9～12 d；從陽性樣品的平均OD值看，母源抗體也呈現逐漸衰減趨勢。

表2 2次豬腹瀉二聯活苗免疫乳汁中IgA抗體動態變化

2.2.2 2次豬腹瀉二聯活苗加1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫IgA持續時間檢測 結果如表3所示，2次豬腹瀉二聯活苗加1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫組(第4組)母豬乳汁中IgA抗體在前6天陽性率為100%，第9天陽性率為90%，在第12天降至70%，第15天降至40%；IgA抗體可持續12～15 d;從陽性樣品的平均OD值看，母源抗體也呈逐漸下降衰減趨勢，比單純2次豬腹瀉二聯活苗免疫下降稍緩和。

表3 2次豬腹瀉二聯活苗加1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫乳汁中IgA抗體動態變化

加1次豬腹瀉二聯滅活苗免疫的目的是盡可能維持IgA持續時間，從表2和表3結果可知，加1次免疫能增加母源IgA抗體持續的時間，但是會增加免疫成本且影響工作效率，在實際工作中可根據情況選擇免疫2次或免疫3次，本試驗結果表明免疫2次豬腹瀉二聯活苗獲得IgA抗體持續的時間可以保護仔豬度過危險期。

3 討論

大量的研究表明，豬流行性腹瀉的免疫主要依靠黏膜免疫，高水平的母源IgA抗體與保護仔豬抵抗PEDV感染呈正相關，初乳中的PEDV 中和抗體滴度與血清中的IgA 抗體具有相關性[3],通過刺激動物機體產生高水平的分泌型IgA抗體，是PED疫苗免疫和防治的關鍵。本試驗通過比較豬腹瀉二聯活苗與滅活苗的不同免疫組合對母豬初乳中IgA抗體水平的影響，得出接種2次豬腹瀉二聯活苗加1次豬腹瀉二聯滅活苗的母豬初乳中IgA抗體水平最高，整齊度最好，但成本相對于2次豬腹瀉二聯活苗偏高，并且免疫操作多1次，增加工作量和母豬應激；其次是2次豬腹瀉二聯活苗組合。疫苗組合效果的順序與王娟萍等[5]、王艷豐等[6]的研究結果相近，每個組合的豬只免疫后的陽性率有差異，可能與選用的滅活疫苗抗原含量有差異相關。從本試驗結果來看，豬腹瀉二聯滅活苗單獨使用免疫效果欠佳，一定要與豬腹瀉二聯活苗或活毒馴化配合使用，才能更好的發揮免疫作用。

徐宏軍等[7]進行的仔豬攻毒保護試驗結果顯示，商品化PED滅活疫苗免疫組斷奶仔豬出現腹瀉，腹瀉保護率為60%，未達到有效性標準。由于我國目前所使用的商品化滅活苗通常不能有效激發機體的黏膜免疫，這可能是滅活疫苗免疫保護效果不佳的原因之一，滅活疫苗需要與活疫苗組合免疫才能產生高水平抗體，本試驗中2次豬腹瀉二聯滅活苗免疫產生的IgA抗體水平最差，與徐宏軍等[7]的研究結論一致，因此不建議滅活疫苗單獨使用。有研究表明，PEDV感染仔豬機體后，病毒的主要靶器官是腸道、腸系膜淋巴結,如果感染時間早、持續時間長，會導致消化器官嚴重的病理損傷[8]，腸道黏膜免疫中分泌型IgA抗體非常重要。通過后海穴注射疫苗，尤其是免疫弱毒活苗，可以很好的刺激母豬產生大量 IgA 抗體分泌到乳汁中形成分泌型IgA抗體，從而為新生仔豬提供被動免疫保護[9]。

綜上所述，綜合考慮養殖場實際操作情況和生產成本，推薦豬場豬流行性腹瀉的免疫程序為：妊娠母豬產前40 d、20 d各免疫1次豬腹瀉二聯活苗，或產前60 d、40 d各免疫1次豬腹瀉二聯活苗，產前20 d于后海穴注射豬腹瀉二聯滅活苗，在加強基礎母豬免疫的同時，也要注意加強對后備豬的免疫，加強生物安全設施升級，嚴格執行生物安全操作程序，進場人員遠離傳染源，通過生物安全操作程序嚴格處理進場物資、車輛、人員，切斷傳播途徑，通過綜合防控措施控制好PED。